[目的]肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)侵袭和转移是制约其预后的重要因素,而侵袭性伪足(invadopodia)形成及发挥基质降解功能是HCC侵袭转移的关键早期事件。然而,目前调节侵袭性伪足形成的分子机制仍不完全清楚。带有5个SH3域的酪氨酸激酶底物(tyrosine kinase substrate with five SH3 domains,Tks5)是侵袭性伪足关键支架蛋白,Src介导的Tks5酪氨酸557/619位点(mTks5-Y557/619,相当于hTks5-Y530/Y592)磷酸化可促进侵袭性伪足相关蛋白招募,最终形成侵袭性伪足。成虫大盘基因类似物5(discs large homolog 5,Dlg5)是膜相关鸟苷酸激酶家族成员,既往研究显示Dlg5对维持粘附连接及上皮细胞极性重要,且Dlg5在多种侵袭性肿瘤表达下调,但其调控癌细胞侵袭转移的机制研究较少。近期研究显示在前列腺癌PC-3及肾上皮LLc-PK1细胞中Dlg5可与肌动蛋白纤丝桥梁蛋白(Girders of actin filament,Girdin)结合,抑制 Akt 介导的 Girdin 丝氨酸 1416位点磷酸化。由于Girdin定位于小鼠NIH3T3-Src-Y527F细胞侵袭性伪足,且Girdin对FAK酪氨酸397和Src酪氨酸418位点磷酸化必须,后两者涉均及Tks5活化及侵袭性伪足产生,我们推测Dlg5可能通过一种涉及Girdin、Tks5的机制调控侵袭性伪足的形成及功能。本课题旨在研究:1、HCC及癌旁组织中Dlg5是否存在表达差异,及HCC组织中Dlg5低(高)表达是否对临床指标产生影响;2、HCC细胞中Dlg5是否通过调控Girdin及Tks5相互作用及活化调控侵袭性伪足形成和发挥功能;3、进而Dlg5是否影响体外HCC侵袭及体内HCC生长和转移。[方法]1、临床组织水平研究:收集昆明医科大学第二附属医院2008年至2009年病例资料完整、术前未行其他肿瘤治疗的HCC及对应癌旁标本100例,随访至2015年底,应用免疫组织化学技术检测上述标本中Dlg5蛋白表达,临床关联分析/分层分析Dlg5蛋白表达高低与临床病理指标的相关性及对预后的影响。2、体外细胞表型研究:(1)人永生化正常肝细胞系HL-7702,人肝癌细胞系 HepG2,SMMC-7721,SK-Hepl,及 MHCC97-L 常规培养。应用 Western blot技术检测上述细胞系中Dlg5蛋白表达。(2)采用 pLKD-CMV-PuroR-U6-Dlg5-shRNA 慢病毒稳定敲减 HepG2 细胞中 Dlg5 表达,pLKD-CMV-PuroR-U6-Ctrl-shRNA 作为对照;应用 Western blot、倒置相差显微镜技术检测Dlg5敲减对HepG2细胞上皮间质转化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白表达及细胞形态的影响;应用免疫荧光共定位显微技术检测Dlg5敲减对HepG2细胞侵袭性伪足形成、明胶降解功能的影响;应用Transwell Matrix侵袭实验检测Dlg5敲减对HepG2细胞侵袭能力的影响。侵袭性伪足形成定义为Tks5或Cortactin(在Tks5敲减时)与F-actin共定位点;侵袭性伪足相关明胶降解定义为F-actin与荧光明胶降解区域共定位点。(3)采用pcDNA3.1(+)-Dlg5过表达质粒阳离子脂质体法转染SK-Hepl细胞,pcDNA3.1(+)空载体为对照,应用Western blot技术检测Dlg5过表达对SK-Hep1细胞EMT相关蛋白表达的影响;应用免疫荧光共定位显微技术检测Dlg5过表达对SK-Hep1细胞侵袭性伪足形成、明胶降解功能的影响;应用Transwell Matrix侵袭实验检测Dlg5过表达对SK-Hep1细胞侵袭能力的影响;应用MTT绘制生存曲线。(4)在上述HepG2/shDlg5及HepG2/shCtrl细胞,采用pLKO.1-Neo-Girdin-shRNA 及 pLKO.1-Neo-Tks5-shRNA 慢病毒感染分别敲减Girdin及Tks5表达,pLKO.1-Neo-Ctrl-shRNA作为为对照;同时采用搭载shRNA抵抗的Girdin、Tks5、或磷酸化缺陷变异Tks5-Y530/592F cDNA的腺病毒(pDC316穿梭质粒构建)或空载体腺病毒感染挽救或不挽救上述对应细胞Girdin 或 Tks5 表达,采用 Western blot 检测上述细胞 Dlg5、Tks5 或 Girdin、β-tubulin表达,采用免疫共沉淀检测Tks5酪氨酸磷酸化水平,利用免疫荧光共定位显微技术及Transwell Matrix侵袭实验分别检测侵袭性伪足形成、明胶降解功能、及细胞侵袭能力的改变。3、体外分子机制研究:(1)在HepG2/shDlg5及HepG2/shCtrl细胞,感染搭载shRNA抵抗的Dlg5 cDNA的腺病毒(pDC316穿梭质粒构建)或空载体腺病毒,采用免疫共沉淀技术、免疫荧光共定位显微技术,检测Dlg5、Girdn、Tks5三种分子间相互作用关系;(2)在HepG2/shDlg5及HepG2/shCtrl细胞,采用pLKO.1-Neo-Girdin-shRNA慢病毒敲减Girdin表达,pLKO.1-Neo-Ctrl-shRNA作为为对照,同时采用搭载shRNA抵抗的Girdin cDNA的腺病毒(pDC316穿梭质粒构建)或空载体腺病毒感染挽救或不挽救上述细胞Girdin表达,采用免疫共沉淀技术,检测Dlg5敲减对Girdin、Tks5、FAK、Src关键位点磷酸化影响,及Dlg5敲减后Girdin对Tks5、FAK、Src关键酪氨酸磷酸化影响。在HepG2/shDlg5及HepG2/shCtrl细胞,使用FAK、Src特异性抑制剂(PF-573228及SU-6656)处理,DMSO为对照,采用免疫共沉淀技术,检测FAK、Src磷酸化活化对Tks5酪氨酸磷酸化影响。(3)在 HepG2/Dlg5 及 HepG2/Ctrl 细胞,不同浓度(0、5ng/ml、或 10ng/ml)TGF-β1处理72h,采用Western blot技术检测Dlg5表达,免疫共沉淀技术再次验证 Dlg5、Girdin、Tks5 三者相互作用关系,及 Dlg5 对 Girdin、Tks5、FAK、Src关键位点磷酸化影响。4、体内研究:采用Dlg5稳定过表达或空载质粒转染的SK-Hep1细胞建立BALB/c裸鼠原位移植瘤模型。饲喂35天后,采用PET/CT、组织学技术检测Dlg5表达对裸鼠原位肝癌移植瘤肝肺转移及生长能力的影响。[结果]1、临床组织水平研究:(1)免疫组织化学检测显示人HCC组织中Dlg5蛋白表达低于癌旁组织(半定量结果中等-强表达/无-弱表达:癌28/72 vs.癌旁70/30,P<0.001)。(2)临床关联分析显示HCC中Dlg5表达降低与肿瘤结节增加(≥2多结节/单结节:高表达6/22 vs.低表达32/40,P= 0.033)、血管侵犯(侵犯/未侵犯:高表达5/23 vs.低表达29/43,P=0.034)、细胞分级(EdmondsonⅢ-Ⅳ/ⅠⅡ:高表达 4/24 vs.低表达 31/41,P=0.007)和 TNM 分期(TNM Ⅲ-Ⅳ/Ⅰ-Ⅱ:高表达2/26 vs.低表达25/47,P= 0.005)增高,及较差的总生存率(中位总生存期:高表达69个月vs.低表达20个月,P = 0.010)和无病生存率(中位无病生存期:高表达48个月vs.低表达16个月,P=0.017)密切相关。2、体外细胞表型研究:(1)人HCC细胞系中Dlg5蛋白表达较正常肝细胞系低,且高侵袭性HCC细胞系(SK-Hep1、MHCC97L)中Dlg5蛋白表达较低侵袭性HCC细胞系(HepG2、SMMC-7721)低。(2)在HepG2细胞,Dlg5下调造成上皮细胞标志蛋白E-cadherin表达下降,间质细胞标志蛋白α-平滑肌肌动蛋白(alpha-smooth muscle actin,α-SMA)和Fibronectin表达增加,细胞形态由鹅卵石样向成纤维细胞样转变;同时Dlg5下调促进侵袭性伪足形成:含有侵袭性伪足的细胞百分数从对照组平均值5%上升至Dlg5敲减时20%～25%(P<0.05),每个细胞侵袭性伪足数目从对照组平均值0.3上升至Dlg5敲减时1.5-1.8(P<0.05);促进侵袭性伪足功能成熟:带有明胶降解的细胞百分数从对照组7%上升至Dlg5敲减时30%～35%(P<0.05),每个细胞相对降解区域从对照组1上升至5-6(P<0.05);及促进细胞侵袭能力提高(提高～2倍,P<0.05)。(3)在SK-Hep1细胞,Dlg5过表达抑制间质细胞标志蛋白α-SMA和Fibronectin表达,部分恢复上皮细胞标志蛋白E-cadherin表达;同时抑制侵袭性伪足形成(含有侵袭性伪足的细胞百分数平均值:20%vs.5%,P<0.05)、功能成熟(带有明胶降解的细胞百分数:30%vs.5%,P<0.05)、及细胞侵袭能力(下降～66%,P<0.05),但未影响细胞生长。(4)在HepG2/shDlg5细胞,再敲减Tks5或Girdin抑制了 Dlg5敲减诱导的侵袭性伪足形成(含有侵袭性伪足的细胞百分数:与单独敲减Dlg5相比,再敲减Tks5下降～90%,再敲减Girdin下降>90%,P均<0.05)及明胶降解功能成熟(带有明胶降解的细胞百分数:与单独敲减Dlg5相比,再敲减Tks5下降>90%,再敲减Girdin下降>90%,P均<0.05),及侵袭能力(与单独敲减Dlg5相比,再敲减Tks5下降～40%,再敲减Girdin下降>90%,P均<0.05)的提高,采用WT Tks5,而不是非磷酸化变异Tks5-Y530/592F挽救Tks5表达或采用WT Girdin挽救Girdin表达后Dlg5敲减引起的侵袭性伪足形成、明胶降解功能及细胞侵袭能力恢复。3、体外分子机制研究:(1)在HepG2细胞,免疫共沉淀显示Dlg5可结合Girdin,反义亦然;但Dlg5未能共沉淀Tks5;对照组细胞Girdin与Tks5相互作用较少,Dlg5敲减后相同量的Girdin能共沉淀更多Tks5,反之亦然;挽救Dlg5表达,Girdin与Tks5间相互沉淀又减弱。免疫荧光共聚焦显微观察到对照组细胞Girdin与Tks5共定位程度低,Dlg5敲减后Girdin与Tks5共定位在类似侵袭性伪足斑点状结构(Girdin与Tks5共定位Pearson相关系数:对照组0.2 vs.Dlg5敲减组0.5～0.6,P<0.05),挽救Dlg5表达,Girdin与Tks5共定位程度下降(Girdin与Tks5共定位Pearson相关系数:Dlg5敲减组0.6 vs.Dlg5挽救组0.2,P<0.05)。(2)免疫沉淀显示:在HepG2/shDlg5细胞较HepG2/shCtrl细胞,Girdin-pS1416、Girdin-pY1764、Tks5 酪氨酸磷酸化、FAK-pY397、及 Src-pY416增加;在HepG2/shDlg5细胞,再敲减Girdin,Dlg5敲减诱导的Girdin-pS1416、Girdin-pY1764、Tks5 酪氨酸磷酸化、FAK-pY397、及 Src-pY416 活化被抑制;在此基础上挽救Girdin表达,Dlg5敲减诱导的Girdin-pS1416、Girdin-pY1764、Tks5酪氨酸磷酸化、FAK-pY397、及Src-pY416活化恢复。在HepG2/shDlg5细胞,FAK及Src特异性抑制剂(PF-573228及SU-6656)处理造成Dlg5敲减诱导的Tks5酪氨酸磷酸化、FAK-pY397、及Src-pY416活化被抑制。(3)在HepG2细胞,TGF-βl处理72hDlg5下调,呈浓度依赖性:外源性表达Dlg5几乎废除了 TGF-β1这种作用;同时TGF-β1处理促进Girdin与Tks5相互结合,亦呈浓度依赖性,且该作用在外源性表达Dlg5时被废除。]Ong/ml TGF-β1 处理 72h 增加了 Girdin-pS1416、Girdin-pY1764、Tks5 酪氨酸磷酸化、FAK-pY397、及Src-pY416活化,该作用在外源性表达Dlg5时被废除。10ng/ml TGF-β1处理72h增加了 HepG2细胞侵袭性伪足形成(含有侵袭性伪足的细胞百分数5%vs.35%,P<0.05)及功能(带有明胶降解的细胞百分数5%vs.45%,P<0.05),该作用在外源性表达Dlg5时被废除。4、体内研究:(1)microPET/CT显示Dlg5过表达抑制了 SK-Hep1细胞原位移植瘤裸鼠模型肺内18F-氟脱氧葡萄糖(18F-fluorodeoxyglucose,18F-FDG)标准摄取率(Standard uptake value,SUV,对照组平均值1.8 vs.Dlg5过表达组0.7,P<0.05)。(2)组织学检测显示Dlg5过表达抑制了 SK-Hep1细胞原位移植裸鼠模型肝、肺转移瘤的数目(肝肿瘤结节个数的中位数,对照组15 vs.Dlg5过表达组5,P<0.05;肺肿瘤结节个数的中位数,对照组4 vs.Dlg5过表达组1,P<0.05)和大小(肝内直径>0.5mm的肿瘤结节个数的中位数,对照组9vs.Dlg5过表达组3,P<0.05;肺内直径>0.5mm的肿瘤结节个数的中位数,对照组3vs.Dlg5过表达组0,P<0.05)。[结论]我们的数据首次证明:1、Dlg5在HCC组织较癌旁标本表达显著降低,HCC组织中Dlg5表达水平降低与肿瘤侵袭转移指标及预后不良相关;2、Dlg5下调可增强HCC细胞侵袭能力,至少部分通过促进侵袭性伪足形成及基质降解能力实现。3、Dlg5下调促进细胞侵袭性伪足形成的作用,至少部分依赖于涉及Girdin与Tks5的分子机制。4、Dlg5可抑制Girdin与Tks5相互结合,而这种结合有可能对Tks5磷酸化活化重要,从而促进侵袭性伪足产生。5、TGF-β1可下调Dlg5表达,故可作为Dlg5/Girdin/Tks5通路生理性调节因子,促进侵袭性伪足形成及功能。6、过表达Dlg5可抑制SK-Hep1细胞裸鼠原位移植模型肝、肺转移瘤的数目和大小。由于Dlg5下调同时促进EMT,这些研究结果提供了一个新的模型,在此模型中一个分子(Dlg5)同时调控EMT和侵袭性伪足形成两种细胞行为,从而促进癌细胞侵袭能力最优化。该研究至少部分阐释了肝癌侵袭转移的分子机制,也为Dlg5作为肝癌转移、复发、预后预测因子提供实验基础和理论依据。