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目的:探索乙肝表面抗原HBsAg对KPNA2核转运功能的抑制作用,探讨其在分子水平以及细胞水平层面对肝细胞癌的抑制作用。方法:1.RT-q PCR和Western Blot分别检测LO2细胞和SMMC7721细胞中KPNA2 mRNA以及蛋白表达水平。2.以实验室已有的重组质粒pIRES2-HBsAg为模板,设计孪生PCR引物得到HBsAg片段插入pIRES2-EGFP质粒中,以SMMC7721细胞中c DNA为模板,在Gen Bank(NM-002266)中查找KPNA2基因序列,并依据KPNA2序列设计克隆引物,将获得的KPNA2片段与上述质粒构建成为pIRES2-HBsAgKPNA2共表达载体。3.伊维菌素以不同的浓度处理细胞,核质分离实验检测E2F1蛋白核内外表达变化,获得最佳的处理浓度。4.Control和p-HBsAg质粒分别转染SMMC7721细胞,免疫共沉淀Co-IP验证HBsAg是否在SMMC7721细胞内与KPNA2结合。5.Control,p-HBsAg,p-KPNA2,p-HBsAg-KPNA2质粒分别转染SMMC7721细胞,伊维菌素处理SMMC7721细胞,核质分离检测E2F1、cMyc、PLAG1、STAT3蛋白核内外表达差异。6.Control,p-HBsAg,p-KPNA2,p-HBsAg-KPNA2质粒分别转染SMMC7721细胞,伊维菌素处理SMMC7721细胞。通过RT-q PCR检测PDGF、AKt、Foxo3a、IGFII、cyclin D1的mRNA表达水平差异。7.Control,p-HBsAg,p-KPNA2,p-HBsAg-KPNA2质粒分别转染SMMC7721细胞,伊维菌素处理SMMC7721细胞。CCK8实验分别检测SMMC7721细胞被处理24h,48h,72h后于OD450nm处的吸光度并做比较;EDU成像实验检测转染48h后的SMMC7721细胞的增殖情况。8.p-HBsAg,p-KPNA2,p-HBsAg-KPNA2质粒分别转染SMMC7721细胞,伊维菌素处理SMMC7721细胞,采用细胞划痕、迁移和侵袭实验对细胞的运动能力进行检测并作比较;结果:1.SMMC 7721细胞中KPNA2 mRNA以及蛋白表达水平明显高于LO2细胞。2.通过1%琼脂糖凝胶电泳检测重组质粒的酶切消化产物,目的条带位置与预期一致,生物公司的测序结果符合实验设计。3.Control和p-HBsAg质粒分别转染SMMC7721细胞,免疫共沉淀Co-IP验证HBsAg在SMMC7721细胞内与KPNA2结合。4.伊维菌素的浓度为5u M时对KPNA2的核转运能力抑制最强。5.Control,p-HBsAg,p-KPNA2,p-HBsAg-KPNA2质粒分别转染SMMC7721细胞,伊维菌素处理SMMC7721细胞,核质分离实验结果显示pHBsAg,伊维菌素组E2F1,c-Myc,PLAG1蛋白核内表达水平相较control,pHBsAg-KPNA2,p-KPNA2组显著下降。p-KPNA2组及p-HBsAg-KPNA2组STAT3蛋白核内表达水平明显高于control,p-HBsAg,伊维菌素组。6.Control,p-HBsAg,p-KPNA2,p-HBsAg-KPNA2,质粒分别转染SMMC7721细胞,伊维菌素处理SMMC7721细胞,RT-q PCR结果显示pHBsAg,伊维菌素组PDGF,AKt,IGFII mRNA的表达水平较较control,pHBsAg-KPNA2,p-KPNA2组显著下降,而Foxo3a的mRNA水平显著上升。control组cyclin D1 mRNA水平明显高于p-HBsAg组及伊维菌素,而明显低于p-KPNA2组,p-HBsAg-KPNA2组。7.Control,p-HBsAg,p-KPNA2,p-HBsAg-KPNA2质粒分别转染SMMC7721细胞,伊维菌素处理SMMC7721细胞。Control,p-HBsAgKPNA2,p-KPNA2组在OD450nm处的吸光度随时间不断增长。而HBsAg组及伊维菌素组DNA复制能力明显低于control,p-HBsAg-KPNA2,p-KPNA2组。8.Control,p-HBsAg,p-KPNA2,p-HBsAg-KPNA2质粒分别转染SMMC7721细胞,伊维菌素处理SMMC7721细胞。p-HBsAg及伊维菌素组细胞划痕面积明显大于control和p-KPNA2组,p-HBsAg-KPNA2组;细胞迁移及侵袭实验显示与control,p-HBsAg-KPNA2和p-KPNA2组相比,p-HBsAg,伊维菌素组迁移和侵袭的细胞数量明显降低。结论:HBsAg通过结合KPNA2抑制E2F1,c-Myc,PLAG1入核,从而抑制PDGF,AKt,IGFII,cyclin D1表达,上调Foxo3a表达,抑制肝细胞癌。