杂草抗药性的问题日益凸现,严重威胁世界农业生产。除草剂不仅要考虑如何更有效地杀灭杂草,更要以适应环境、安全无公害为出发点,做到作用机理独特,选择性强,对环境和人类安全。因此挖掘和设计新型除草剂,解析活性小分子与靶点蛋白相互作用的分子机制,是基于环境保护和农业可持续发展的要求。支链氨基酸（包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸）是植物生长必需的营养成分,其生物合成途径由乙酰乳酸合酶（ALS）、乙酰羟酸异构还原酶（KARI）和二羟酸脱水酶（DHAD）这三个酶组成。哺乳动物体内不存在BCAA生物合成途径,它们依靠食物摄取这些三种必需氨基酸,因此ALS、KARI和DHAD被认为是理想广谱除草剂设计的靶点。DHAD催化α,β-二羟酸脱水反应生成亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸的前体α-酮酸,该酶在不同的植物物种中高度保守。在前期工作中,南京农业大学的合作团队在已知的DHAD-AA复合物结构（待发表）基础上,通过计算机辅助药物设计得到并合成出十余个DHAD的小分子抑制剂,功能实验表明它们具有一定的除草活性。我的硕士论文工作是与他们合作,首先通过生物化学方法筛选出抑制活性最高的小分子抑制剂,再解析小分子抑制剂与DHAD靶蛋白的复合物晶体结构,为新型除草剂的设计优化提供理论支撑。我的论文工作主要包括四方面的内容:1.靶蛋白DHAD的表达纯化,采用厌氧纯化的方法获得含有稳定[2Fe-2S]铁硫簇活性中心的目标蛋白,目标蛋白的纯度大于98%。2.摸索并找到生物化学方法对12种不同小分子抑制剂的活性进行测试,最终筛选到IC50值为1.2 m M的11#小分子抑制剂,与天然产物AA的抑制活性存在较大差距。结合SMT分析技术,测试3种新型小分子抑制剂,获得抑制活性高于小分子11#的小分子H259。3.通过孵育浸泡法制备得到DHAD蛋白与小分子H259的复合物晶体,解析得到分辨率为2.19?的DHAD-H259复合物晶体结构,结构分析解释了H259小分子与DHAD蛋白结合力为何不及天然产物AA。4.通过结构信息可知,小分子H259与Mg2+形成6配位结构,其中羰基结构的配位距离超过正常配位距离,而小分子的疏水结构不能稳定在疏水口袋,使得结合力不如天然产物。本论文幸运地获得了弱结合相互作用的DHAD-H259复合物晶体结构,为未来小分子抑制剂的设计提出三点指导性建议。（1）增加小分子疏水结构的疏水相互作用;（2）使用羧基和羟基与Mg2+形成6配体结构;（3）减小N原子侧链的空间位阻;