立题依据和目的 血清阴性脊柱关节病(spondyloarthropathy，SpA)是一组累及脊柱、周围关节及其周围软组织的风湿性疾病。关节病变除有疼痛外尚伴有肿胀和活动障碍，呈发作与缓解交替的慢性炎症过程，严重者可出现关节致残和内脏功能衰竭。SpA包括强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，As)、反应性关节炎和Rei．te综合征、银屑病关节炎、炎性肠病关节炎、幼年起病脊柱关节病等。其中以AS最常见，并具有代表性。该病起病隐匿而缓慢，发病年龄多在15-30岁，男性多于女性且男性患者的症状远较女性重。AS的患病率在各国报道不一，我国患病率初步调查为0.26％。其发病机制至今不明，流行病学调查发现，其发病机制涉及了遗传易感基因和环境因素、感染因素的共同作用。目前有很多学者将AS划归全身性自身免疫性疾病。AS有明显的家族聚集倾向，AS家庭中一级亲属患AS的概率在2.4％左右，本病另一重要特点是与人类白细胞抗原B27(HLA-B27)强相关，这种关联在已知HLA与疾病的关联性中最强，相对危险值高达81.8，HLA-B27阳性者患AS的概率较HLA-1327阴性者高20-40倍。关联分析和转基因动物模型研究都提示HLA-B27抗原是引起此类炎症性疾病最主要的危险因素，将HLA-B27基因转至大鼠，可导致转基因大鼠发生强直性脊柱炎。家系和双生子资料表明除HLA-B27以外，还有其他遗传基因参与该病的发生，说明As应归属于多基因遗传病，在遗传易感的基础上，由环境因素或/和感染因素触发和促进自身免疫反应的发生。AS患者在多个层面存在细胞免疫功能紊乱，其体内存在着TH1/TH2平衡的偏移，TH1激活程度低下，而TH2激活程度增强，细胞因子水平的改变尤以TH1细胞因子TNF-a降低特别明显。 自然杀伤细胞(N K)是机体免疫系统抗肿瘤和病毒感染的第一道防线，同时又能通过早期分泌多种细胞因子来调节获得性免疫应答。在免疫应答中，N K细胞受体承担着识别靶细胞的功能，监控细胞MHC分子的正确装配，NK细胞表面受体一旦识别其相应的HLA-I配基特定的氨基酸残基，产生活化或抑制信号，将导致靶细胞裂解或抑制细胞裂解。已知KIR2D分子的配体为HLA-Cw，KIR分子中2DL1/2DS1特异性识别位点是位于HLA-Cw*02，04，05，06分子α重链上第80位的赖氨酸。2DL2/2DL3、2DS2/2DS3特异性识别Cw*01，03，07，08分子α重链上第80位的氨基酸为天冬氨酸。KIR与HLA均为共显性表达，而且KIR的表达强度不受HLA的影响。因此，KIR和HLA在DNA水平和蛋白质水平是一致的。个体的KIR和HLA表型决定了个体NK细胞与自身组织细胞间的作用方式。 NK细胞发育的正常过程确保循环中的NK细胞对自身健康细胞的耐受，这种状态依靠NK细胞受体与自身HLA-I类分子配体的相互作用。NK细胞受体分为两个家族：免疫球蛋白样受体家族和C型凝集素(C-lectin)受体家族。前者包括杀伤细胞免疫球蛋白样受体(Killer cell Ig-like receptors，KIRs)，白细胞免疫球蛋白样受体(Leukocyte immunoglob μlin-like recep-tors，LILR)，白细胞相关抑制受体(Leukocyte-associated inhibitory receptors。LAIR)和NK细胞活化受体NKp46。KIRs由位于染色体19q13.4上的跨距约150 kb、“头尾排列”、聚集成簇和多态性丰富的多基因家族编码，迄今发现KIR基因家族有14个KIR基因和2个假基因。KIRs是继HLA后发现的具有高度多态性的免疫调节基因家族，主要存在于NK细胞和部分CD8*T细胞表面，能与主要组织相容性复合体(MHC)和/或非MHC类配体结合，通过介导免疫效应细胞(NK细胞和T细胞)的抑制或活化信号，参与机体先天性和获得性抗肿瘤免疫、抗感染免疫、抗病毒免疫应答、母胎耐受、免疫监视和免疫耐受的调节。KIR根据功能分为抑制性和活化性两类受体。KIRs的膜外区有免疫球蛋白(Ig)样结构域，属于免疫球蛋白超家族。KIRs具有遗传多态性，不同地区、不同种族和不同个体、不同NK细胞克隆，KIRs的表达格局、基因数目均存在差异，而且KIR的多态性还表现在同-KIR基因座位包含多个等位基因，类似于HLA-DR的基因多态性。虽然KIRs在NK细胞和T细胞上的表达是克隆性的，但个体的基因型是其表达的决定性因素。 近年来，KIR基因与感染性疾病和自身免疫性疾病遗传易感性的的关系以及KIR与HLA-CW组成免疫抑制信号传导系统在免疫调节中发挥的作用引起人们的关注。研究发现，抑制性/活化性KIRs基因的失衡可能和I型糖尿病、银屑病性关节炎等自身免疫病相关。为探讨KIRs及HLA-Cw在AS发病中的作用，本研究采用序列特异性引物聚合酶链反应(PCR-SSP)基因分型技术分析AS患者KIRs基因及HLA-Cw等位基因，由KIR基因型推断单倍型，计算KIRs基因频率、抑制性和活化性KIR基因数目，同时以正常人群做对照，探讨KIRs以及其相应的配体HLA-Cw等位基因基因多态性与AS和的相关性。 资料与方法 1、临床资料筛选山东省立医院风湿免疫科门诊和住院As患者86例作为研究组，所有病例符合1985年全国部分省市中西医结合风湿病学术座谈会制定的诊断标准，且HLA-B27阳性。年龄8~68岁，其中，男71例，女15例。正常对照412例，为山东省立医院健康查体的无血缘关系的随机个体、山东省和济南市中心血站自愿献血者。对照组无自身免疫性疾病，年龄10~70岁，其中，男260例，女152例。 2．研究方法 2．1基因组DNA抽提As病例和健康对照均取静脉血5ml，EDTA-K2防凝，-20℃保存。用本室研制DNA提取试剂盒提取全血基因组DNA，-20℃保存。 2．2 KIR基因序列特异性引物聚合酶链式反应(sequence-specific primerpolymerase chain reaction，PCR/SSP)参照文献及IHWG推荐的引物序列，共合成30对引物，由上海博亚生物工程有限公司合成，用PCR/SSP方法进行KIR基因频率检测。HLA-Cw参照文献共合成引物13对，分别检测HLA-Cw*01-08等位基因。 2．3对照以KIR框架基因3DL2、3DL3、2DL4为阳性对照，以不含DNA的PCR体系作阴性对照。 2．4结果判断PCR产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳，凝胶电泳成像仪观察泳带并保存图象。根据电泳的结果，对患者组和对照组人群KIR基因的基因频率、基因型频率及HLA-Cw等位基因频率进行分析比较。 2．5统计学方法：每个KIR基因及HLA-Cw等位基因频率出现频率(pf,％)通过计数测得，pf(％)=基因阳性数/N×％(N为研究组例数)；基因频率(genefrequency，GF)计算公式为：GF=1-平方根(1一pf)；KIR单倍型频率(haplotypefrequency)=单倍型阳性数/2N(N为研究组例数)。患者组与正常对照组间差异显著性用SPSS软件计算。 结果： 3．1与正常对照人群相比，AS患者活化性基因KIR3DS1出现频率和基因频率显著增高(P<0.05)，其他KIR基因位点频率差异无统计学意义。 3．2活化性KIR基因数量和AS相关性：携带2个或2个以上活化性KIR的个体在AS患者组占77.91％，在对照组占33.7496，而携带1个活化性KIR的个体AS组占22.09％，在对照组占66.26％，两者差异具有显著性(P<0.05)。 结论： 1) KIR基因失衡可能和AS的免疫病理有关： 携带2个及2个以上活化性KIR基因的AS患者明显高于对照组，致使抑制性和活化性KIR受体的失衡，可能降低了NK细胞和细胞毒性T淋巴细胞的活化阈值，对自身组织产生免疫应答。 2) 在特异性配体HLA-Cw-Lys<80>存在时，KIR2DS1可能是AS的一个易感基因。 3) KIR3DS1可能是是AS的一个易感基因。 本研究提示KIR基因及其配体HLA-Cw等位基因平衡紊乱有可能打破NK细胞和/或T细胞受体平衡，使NK细胞和/或T细胞功能异常而打破机体的免疫自稳状态，可能是导致强直性脊柱炎的免疫因素。