类脂A是脂多糖的重要活性成分,其结构的变化将影响革兰氏阴性菌细胞外膜性质,从而导致细菌耐药性和毒力的变化。磷酸乙醇胺转移酶(EptA)是类脂A的结构修饰酶。磷酸乙醇胺基团的修饰使得类脂A上负电荷减少,从而中和了细菌表面的电负性。这一修饰使得多肽类抗生素与细菌外膜结合能力降低,则机体对革兰氏阴性菌的自身免疫降低。大肠杆菌为重要的模式菌株,构建大肠杆菌磷酸乙醇胺转移酶缺失菌株便于研究脑膜炎奈瑟氏菌和阪崎肠杆菌的磷酸乙醇胺转移酶。通过耐药性实验和细胞实验探索磷酸乙醇胺转移酶影响的细菌耐药性机制以及细菌的致病机理。本课题的主要研究结论如下:(1)通过比对Neisseria meningitidis MC58和E.coli BL21(DE3)磷酸乙醇胺转移酶EptA的同源性,在Neisseria meningitidis MC58中发现EptA编码基因NMB_RS08540,并命名为NmeptA.构建E.coli BL21(DE3)ΔeptA突变菌株,E.coli BL21(DE3)ΔeptA/pET28a-NmEptA表达菌株,发现E.coli BL21(DE3)EptA和Neisseria meningitidis MC58NmEptA都受弱酸环境调控。(2)基于磷酸乙醇胺转移酶蛋白结构的保守性,通过点突变的方式发现Lys150,Trp126,Trp148和Thr280这几个位点是NmEptA的关键位点,Thr279是CsEptA的关键位点。(3)磷酸乙醇胺转移酶NmEptA与菌株对多肽类抗生素耐药性相关,eptA的缺失以及关键位点的突变会菌株对多肽类抗生素敏感。(4)通过菌体对动物细胞的刺激实验,发现eptA缺失菌株对TLR4通路的刺激能力比野生型及表达菌株降低,在THP-1细胞中的存活能力减弱。(5)通过测定细菌生物学特性,eptA的缺失对大肠杆菌的生长有一定的积极影响。缺失eptA大肠杆菌细胞膜特性改变,使得细胞外膜渗透性提高。