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染色(红肉)葡萄品种由于含有高浓度的花色苷,可与其它葡萄品种混酿来改善葡萄酒的颜色和单宁含量或单酿用于其它品种葡萄酒的调色。烟73(Yan73)属于欧亚种(Vitis vinifera L.)染色(红肉)葡萄品种,研究其花色苷的合成及分子调控机制对充分利用染色葡萄品种和选育红肉葡萄新品种具有重要意义。目前关于染色葡萄品种烟73花色苷合成的研究较少,有以下方面需深入研究:一是大多数红色葡萄品种花色苷的积累主要在果皮,但烟73除了果皮,果肉和营养组织(叶片、茎和卷须)也有花色苷积累。烟73果皮花色苷合成的分子调控机制已被报道,但其果肉和营养组织花色苷合成的分子调控机制却不清楚。二是烟73果皮和果肉可合成花葵素类的花色苷,但其分子调控机理尚不清楚。早期的报道因对葡萄DFR的作用底物不清楚,对欧亚种葡萄品种是否存在花葵素类花色苷的合成路径存有争议。本研究利用代谢组学技术对烟73果皮、果肉和营养组织的花色苷组分进行了定性和定量分析,并利用转录组学及RTPCR技术对调控烟73果肉和营养组织花色苷合成的结构基因、R2R3-MYB转录激活子和抑制子进行了初步筛选,利用酵母双杂交、双分子荧光互补、酵母单杂交和双荧光素酶实验等对调控其花色苷合成的转录因子进行了功能性验证;同时为了验证烟73葡萄果皮和果肉是否可合成花葵素类的花色苷,本研究对烟73葡萄果皮和果肉的DFR基因进行了克隆、蛋白表达、蛋白纯化、酶活实验及作用底物分析。本研究获得的主要结果如下:1.证明了欧亚种染色葡萄烟73果皮、果肉和营养组织(叶片、茎和卷须)中花色苷组分存在的差异。烟73葡萄果皮中花翠素类花色苷的浓度高于花青素类花色苷,且二甲基花翠素-3-O-葡萄糖苷浓度最高,而果肉中花翠素类与花青素类花色苷浓度相当,且甲基花青素-3-O-葡萄糖苷浓度最高。烟73葡萄叶片、茎和卷须中花色苷组分相似,其花色苷主要为甲基花青素-3-O-(6-O-反式香豆酰化)-葡萄糖苷,且花青素类花色苷、酰基花色苷和甲基花色苷的含量分别高于对应的花翠素类花色苷、非酰基花色苷和非甲基花色苷。在烟73果皮和果肉中均检测到了花葵素-3-O-葡萄糖苷,且首次检测到了花葵素-3-O-(6-O-乙酰化)-葡萄糖苷,但在其营养组织中未检测到花葵素类的花色苷,烟73果皮和果肉中花青素类和花翠素类花色苷的浓度均显著高于花葵素类花色苷。2.明确了烟73葡萄转色后果肉及营养组织(叶片、茎和卷须)中花色苷合成相关的结构基因上调表达。烟73葡萄绿果期和转色后果肉中有9811个基因呈现差异表达,包括了与黄酮类物质合成相关的24个结构基因,其中与花色苷合成相关的16个结构基因在其转色后的果肉中上调表达。烟73葡萄与其父本品种叶片、茎和卷须组织中分别有10323、9324和6199个基因呈现差异表达,其中烟73葡萄叶片、茎和卷须中较其父本品种分别有30、17和10个与花色苷合成相关的结构基因上调表达,且Vv UFGT、Vv OMT、Vv3AT和Vv GST4等专一性调控花色苷合成的基因在其营养组织均上调表达。3.确定了烟73葡萄转色后果肉及营养组织(叶片、茎和卷须)中上调表达的R2R3-MYB转录激活子和抑制子基因。R2R3-MYB转录因子基因Vv MYBA1、Vv MYB4A和Vv MYBC2-L1等在烟73转色后果肉中上调表达,在系统进化树中Vv MYBA1被聚类在花色苷合成激活子分支上,而Vv MYB4A和Vv MYBC2-L1被聚类在R2R3-MYB C2花色苷合成抑制子分支上。在烟73葡萄果实发育过程中,果肉中Vv MYBA1和Vv MYBC2-L1的表达量与其花色苷积累及其合成相关基因Vv UFGT和Vv LDOX的表达呈现出高的相关性。位于葡萄2号染色体上的Vv MYBA1与14号染色体上的Vv MYBA5、Vv MYBA6和Vv MYBA7转录激活子基因在烟73营养组织中上调表达,且Vv MYBA5和Vv MYBA6基因的表达量最高,Vv MYBC2-L1和Vv MYBC2-L3等R2R3-MYB C2抑制子基因被激活,且在烟73营养组织中上调表达。4.探明了烟73葡萄果肉与营养组织(叶片、茎和卷须)中花色苷合成的分子调控机制存在差异。烟73葡萄果肉中花色苷的合成受Vv MYBA1转录激活子与Vv MYBC2-L1转录抑制子的协同调控,Vv MYBA1通过与Vv WDR1互作且激活Vv CHI3、Vv OMT和Vv GST4的表达正向调控了烟73葡萄果肉花色苷的合成,而Vv MYBC2-L1通过与R2R3-MYB转录激活子竞争Vv MYC1结合位点并抑制Vv OMT和Vv GST4的表达而负向调控了其花色苷的合成。烟73葡萄营养组织中花色苷的合成受两组Vv MYBA转录激活子和Vv MYBC2-L1转录抑制子的协同调控,Vv MYBA1主要通过与Vv MYC1互作并激活Vv F3’5’H和Vv UFGT的表达、Vv MYBA6和Vv MYBA7通过与Vv MYC1互作并激活Vv UFGT的表达正向调控了烟73营养组织中花色苷的合成,而Vv MYBC2-L1主要通过与转录激活子竞争Vv MYC1结合位点负向调控了其花色苷的合成。5.证实了烟73葡萄果皮和果肉的DFR能够还原二氢山萘酚生成无色花葵素。烟73葡萄果皮与果肉中DFR的核酸和氨基酸序列的相似性为100%,且DFR的134号氨基酸均为天冬酰胺,其DFR与苹果(Malus domestica)和山楂(Crataegusmonogyna)的DFR同源性最高。纯化的烟73葡萄DFR蛋白的分子量为37.6 k Da,它更多的是以二氢槲皮素和二氢杨梅素为底物而生成无色花青素和无色花翠素,但也可以还原二氢山萘酚生成少量的无色花葵素。