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研究背景及目的癌症诊疗是全球范围的重大公共卫生问题之一。根据《Cancer Statistics,2019》的统计数据显示,乳腺癌高居全球女性常见癌症的首位,致死率位列前茅。目前以手术治疗、化学治疗、放射治疗、内分泌治疗、靶向治疗及中药治疗为主的乳腺癌治疗体系虽取得一定疗效,但仍面临治疗毒副作用大,肿瘤转移及复发率高等亟待解决的难题。研究靶向、低毒、微创的乳腺癌治疗方式,是生物医学领域面临的重大课题。声动力学疗法（Sonodynamictherapy,SDT）是近年来逐渐发展起来的一种肿瘤治疗新方法。SDT利用超声波固有的组织穿透性强,能量衰减小的特点,将能量有效的聚焦于深部病灶部位,激活富集于肿瘤组织中的声敏剂,并通过超声空化效应、自由基产生、降低耐药性、介导细胞凋亡以及免疫调节等多种机制发挥抗肿瘤作用。该疗法将本身低毒/无毒的声敏剂在病灶组织的选择性富集和超声的精准聚焦相结合,可实现组织靶向性的肿瘤组织杀伤,从而最大程度上降低对周围正常组织的影响。因此SDT对于手术治疗困难,不同癌症患者个性化无创或微创治疗,改善愈后生存质量具有重要意义。声敏剂在SDT治疗中起着至关重要的作用。理想的声敏剂应具有良好声敏性,且能够在病灶组织内特异性滞留,从而实现高效、安全的声动力治疗。传统声敏剂使用存在着生物利用度较低,肿瘤部位累积浓度不佳,药物稳定性易受体内环境影响等局限性。因此探索新型高效声敏剂,克服当前声敏剂存在的缺陷,同时提升声敏剂向肿瘤组织的递送效率是当前SDT领域迫切需要探索的科学问题。纳米技术的快速发展和广泛应用为声敏剂的高效递送及SDT治疗效果的提升提供了新的机遇。相较于小分子药物,纳米级声敏剂更易通过实体瘤的高通透性和滞留效应（Enhanced permeability and retention effect,EPR）特性,促使敏化剂被动靶向富集于肿瘤组织,可减少在非肿瘤组织的蓄积。通过纳米材料携载传统声敏剂或直接采用具有声敏特性的纳米材料作为声敏剂,可以有效改善声敏剂的理化特性或直接参与提升SDT疗效。然而,外源性的纳米声敏剂在临床应用方面仍然面临着许多困难。例如,纳米材料及其降解产物存在潜在的免疫原性和积累毒性,且易被网状内皮系统（Reticuloendothelial system,RES）识别清除。此外,由于肿瘤组织的高度异质性以及体内各种生理病理屏障的存在,在一定程度上削弱了 EPR效应,进一步提升了药物精准递送的难度。近年来,越来越多的研究开始关注来源于细胞自身或亚细胞结构的内源性载体。外泌体（Exosome）是细胞自身分泌的纳米级（30-150nm）囊泡,可携带亲本细胞的信息,广泛参与细胞间的通讯,已被开发应用于疾病的诊断和治疗。由于外泌体的内生性特点,以其作为载体的敏化剂递药系统具有生物相容性好、免疫原性低、具备潜在靶向性等特点,可有效规避外源性材料在治疗中的问题。为了强化敏化剂在肿瘤组织的靶向富集,在多种促进EPR效应的尝试中,发现超声靶向微泡爆破（Ultrasound targeted microbubble destruction,UTMD）技术在促进药物递送和渗透方面有独特的应用优势。本论文选用在前期研究中表现出良好声活性兼具治疗与成像功能的卟啉二聚体钠盐华卟啉钠（Sinoporphyrin sodium,DVDMS）作为声敏剂,采用同源肿瘤外泌体包装策略,构建了内源性的华卟啉钠外泌体纳米声敏剂（EXO-DVDMS）。通过引入引导超声（US1）促进EXO-DVDMS在肿瘤部位的蓄积和渗透,随后采用治疗超声（US2）触发SDT作用,论文系统研究了 EXO-DVDMS在生理条件下的药物保护作用,超声介导下的药物释放和胞内转运特征,以及同源肿瘤靶向性;并以离体培养的小鼠乳腺癌4T1细胞和小鼠乳腺癌荷瘤模型为实验对象,开展引导超声作用下EXO-DVDMS增效SDT抗肿瘤作用的初步分析,旨在为探索运用天然外泌体构建声响应性纳米递送平台,提升SDT抗乳腺癌的疗效提供有价值的理论依据和实验基础。研究方法及结果:1.华卟啉钠外泌体纳米声敏剂（EXO-DVDMS）的制备及其鉴定:实验首先通过筛选PEG分子量及浓度,增加提取前和提取后处理步骤,对文献已报道的PEG沉降分离法进行改良,并将该改良后方法（PEG-8K改良法）提取外泌体与超速离心和商品试剂盒分离的外泌体进行比较,以评估PEG-8K改良方案的适用性;利用荧光酶标仪测定EXO-DVDMS包封率和载药效率;透射电镜（TEM）观察颗粒形貌;NTA和DLS测定颗粒粒径、Zeta电位、粒径稳定性;Western blot检测外泌体标志性蛋白;流式细胞仪（FCM）和高分辨率激光共聚焦（CLSM）共同验证所制备EXO-DVDMS的纯度,以排除未载药外泌体干扰。结果显示:①PEG-8K改良法所提外泌体量为超速离心法10倍以上,粒径适中,稳定性良好,外泌体粒径和蛋白量均与商品化试剂盒提取样品相似,且该步骤可扩展用于多种细胞来源及血液来源外泌体的分离;②药质比为1:15.5,孵育温度为28℃,孵育时间为30分钟为制备EXO-DVDMS的最佳载药条件;所制备EXO-DVDMS呈圆形囊泡结构,颗粒均一,平均粒径为（126.71±3.86）nm,Zeta电位为（-10.67±0.52）mV,单分散性优良,粒径稳定性良好,外泌体标志性蛋白CD9和CD63呈阳性,包封率（EE%）约为84.57%,载药率（DL%）约为5.18%;③EXO-DVDMS颗粒中具有DVDMS荧光信号的阳性颗粒比率高于98.5%,提示EXO-DVDMS具有较高纯度。2.模拟生理条件下外泌体对华卟啉钠的药物保护作用研究:利用DLS测定EXO-DVDMS在模拟体内生理条件（血清、pH、温度）中的颗粒稳定性;采用全波长荧光酶标仪研究不同条件下游离DVDMS（Free-DVDMS）以及EXO-DVDMS的光谱性质;单线态氧探针（SOSG）联合荧光分光光度计检测EXO-DVDMS在正常/模拟生理条件下经超声刺激后的单线态氧产量。结果显示:①24小时内,EXO-DVDMS在模拟生理条件下粒径稳定性良好;②与Free-DVDMS相比,EXO-DVDMS吸收光谱在保留原有369 nm索瑞带的同时,在430 nm处产生了新的吸收峰,其位于516-631 nm之间的4个Q带的峰值均高于Free-DVDMS,而EXO-DVDMS的荧光发射峰峰位与Free-DVDMS相同（640 nm左右）,峰值显著提升。在不同pH、温度及不同存储时间条件下,EXO-DVDMS均显著提升了游离DVDMS的光谱稳定性,避免模拟生理条件下低pH和非特异性蛋白结合对DVDMS理化性质的影响;③在中性条件和酸性条件存放24小时后,EXO-DVDMS经超声刺激下单线态氧产量分别是Free-DVDMS的4.74倍和14.4倍,提示EXO-DVDMS有希望显著提升Free-DVDMS的SDT作用。3.EXO-DVDMS的释药行为分析:采用透析法分析EXO-DVDMS中DVDMS在不同血清浓度、不同pH、不同参数超声刺激下的释药行为;对苯二甲酸（TA）法检测超声处理后EXO-DVDMS溶液中羟自由基的生成;TEM观察超声处理对EXO-DVDMS形态的影响:CLSM观察EXO-DVDMS经超声处理后细胞水平的药物释放行为。结果显示:①低pH及超声可以触发EXO-DVDMS中DVDMS的药物释放;②EXO-DVDMS的加入可在一定范围内以浓度依赖的方式提升体系内羟自由基的产量,说明EXO-DVDMS增强了超声空化作用;③超声处理对空白外泌体没有显著影响,但会造成EXO-DVDMS膜结构变化;④超声刺激可从细胞层面时空可控性触发EXO-DVDMS的胞内释药。4.EXO-DVDMS的细胞摄取和体外同源靶向性研究:通过FCM和CLSM检测EXO-DVDMS的细胞摄取情况。结果显示:①EXO-DVDMS与4T1细胞共孵育3小时即可在胞内观测到对EXO-DVDMS的摄取,共同孵育12小时后,高达98%左右的细胞均对药物进行了内化;②在血清存在条件下,相较于游离药物Free-DVDMS和脂质体药物Lipo-DVDMS,外泌体包装的EXO-DVDMS更容易被其同源肿瘤细胞摄取,其胞内荧光强度分别是Free-DVDMS及Lipo-DVDMS的1.62倍和1.44倍;③EXO-DVDMS在同源4T1细胞中的富集量是非同源细胞的1.81-2.35倍,初步从细胞水平证实EXO-DVDMS的具有同源肿瘤靶向性;④超声刺激可进一步提升细胞对于EXO-DVDMS的摄取,相较于Free-DVDMS,EXO-DVDMS联合超声处理对4T1细胞膜通透性的提升更为显著。5.EXO-DVDMS介导的SDT对乳腺癌细胞的体外杀伤效应:通过MTT,钙黄绿素/PI双染实验研究EXO-DVDMS介导的SDT对小鼠乳腺癌4T1细胞的存活率的影响;DCF及DHE探针联合荧光显微镜和FCM对EXO-DVDMS介导的SDT处理后胞内活性氧（Reactive oxygen species,ROS）和超氧阴离子的产生进行定性及定量分析;CLSM观察超声处理对EXO-DVDMS的亚细胞定位的影响。结果显示:①相较于Free-DVDMS,EXO-DVDMS在相同参数下表现出更强的体外抗肿瘤作用,且EXO-DVDMS联合超声处理对肿瘤细胞的声动力杀伤效应具有明显的剂量依赖性;②EXO-DVDMS联合超声处理后,包括超氧阴离子在内的胞内ROS水平显著高于Free-DVDMS-SDT组;③EXO-DVDMS在被细胞摄取初期首先定位于溶酶体,随后在超声刺激下其细胞定位发生了一定程度的改变,与溶酶体共定位现象减弱,而与线粒体共定位现象增强。表明外加超声作用联合溶酶体低pH条件共同刺激DVDMS从外泌体膜上及腔内分离释放和胞内转运。6.引导超声作用下EXO-DVDMS的体内代谢及同源肿瘤靶向性研究:尾静脉注射EXO-DVDMS和Free-DVDMS后,利用全波长荧光酶标仪测定EXO-DVDMS和Free-DVDMS在小鼠体内的长循环性能;建立小鼠背部单侧、双侧同种、双侧异种荷瘤模型,采用小动物活体成像系统研究EXO-DVDMS的体内富集代谢规律及同源肿瘤靶向能力;采用小鼠背部双侧肿瘤模型,尾静脉给药后,对一侧移植瘤进行超声处理,小动物活体成像系统观察引导超声（1.0 MHz,2W,3 min超声处理+MBs,US1）处理对EXO-DVDMS在肿瘤中富集量的影响;对引导超声处理后肿瘤进行连续冰冻切片,荧光体视显微镜观察肿瘤组织中EXO-DVDMS的分布情况。结果显示:①EXO-DVDMS有效提升了 DVDMS在体内的长循环性能;②EXO-DVDMS在4T1肿瘤的富集量分别是非同源CT26肿瘤中的2.17倍以及非同源B-EXO-DVDMS的2.04倍,初步在在体水平证实EXO-DVDMS具有同源肿瘤靶向性;③超声侧肿瘤中DVDMS的平均光量子强度约为未超声侧肿瘤的2.05倍,同时,US1处理后,肿瘤组织中EXO-DVDMS的渗透深度和分布均匀性都有显著提升;④EXO-DVDMS给药组肿瘤组织中DVDMS平均光量子强度约为Free-DVDMS组的3.22倍。以上结果表明,EXO-DVDMS联合US1处理显著改善了 DVDMS的生物分布、肿瘤积累和体内成像能力。7.多级超声联合EXO-DVDMS-SDT对乳腺癌杀伤作用的在体研究:实验利用4T1移植瘤模型,从在体水平通过对肿瘤生长情况,肿瘤转移情况的研究,分析引导超声协同治疗超声作用下EXO-DVDMS声动力抗肿瘤效果,并对整个治疗的安全性进行了初步评估。结果显示:①EXO-DVDMS联合US1+US2能够显著增效DVDMS-SDT对小鼠乳腺癌4T1移植瘤的治疗效果,H&E染色结果显示出EXO-DVDMS联合US1+US2可以造成肿瘤组织更大程度的损伤,肿瘤组织内TUNEL染色阳性率显著升高,PCNA表达量显著降低,说明该处理模式可显著诱导细胞凋亡,抑制细胞增殖;②EXO-DVDMS联合US1+US2处理组小鼠肺结节显著减少,肺部H&E染色显示肺组织结构趋于正常,肿瘤组织内MMP-9显著下调,说明该处理可显著降低肿瘤肺转移情况;③EXO-DVDMS联合多级超声处理对小鼠体重和主要脏器无明显影响,初步证实这一治疗模式具有较高的安全性。研究结论:本研究通过将天然纳米囊泡引入SDT治疗领域,创新性的采用肿瘤同源外泌体装载兼具成像与治疗功能的卟啉二聚体钠盐DVDMS,构建了具有同源肿瘤寻靶能力的新型内源性纳米声敏剂（EXO-DVDMS）。外泌体的包装成为DVDMS进入生物体的“隐形衣”和“保护伞”,有效避免了模拟生理条件下低pH和非特异性蛋白结合对DVDMS理化性质的影响,极大提升了 DVDMS的光谱稳定性和ROS产量。EXO-DVDMS在超声刺激下可以实现时空性的响应性药物释放,可作为新型超声响应型递药系统。论文所探索的外源超声引导结合内源外泌体同源靶向的双重靶向模式,有效改善了因肿瘤异质性及生理病理屏障带来的EPR作用效果不足的问题,提升了 DVDMS的生物分布、肿瘤积累和体内成像能力。在多级超声治疗与EXO-DVDMS的联合作用下,有效抑制了同源肿瘤的生长和转移,实现了高效、安全性、个性化的SDT治疗。