胚胎干细胞(embryonicstemcell，ESC)是指来源于囊胚内细胞团(innercellmass，ICM)，能无限增殖并保持未分化状态(保持完整的、正常的染色体核型)的细胞，在特定的条件下可分化为全身各种组织来源的细胞。这种生物学特性使ESC成为再生医学的最佳的种子细胞。然而，免疫排斥反应将导致胚胎干细胞移植的失败，解决的方法之一就是在全球范围内建立人胚胎干细胞库。但胚胎来源的限制及伦理问题仍然束缚着人胚胎干细胞研究的发展。因此，利用不适于移植及冻存的废弃胚胎进行胚胎干细胞研究可以较好地缓解这一矛盾。同时，为了更深入地监测移植细胞体内存活、迁移、分化及整合情况，建立高效率的移植细胞示踪技术是再生医学必需解决的关键问题。GFP荧光稳定，对活细胞无毒害，检测方便，易于构建载体且对目的基因的功能也没有影响，转化后细胞可以继续传代。因此绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein，GFP)是常用的标记分子。本研究对低形态学评分D3胚胎发育潜能进行了研究、试图利用这些胚胎建立hESC系并对含不同启动子的GFP载体在不同种属的胚胎干细胞系中表达效率进行了探索性研究。 目的: (1)对IVF周期中低形态学评分D3的胚胎行囊胚培养，观察胚胎评分与囊胚形成率的关系。 (2)利用低形态学评分D3的胚胎进行hESC的分离培养，寻找新的人胚胎干细胞(humanembryonicstemcell，hESC)建系材料来源。 (3)对比含不同启动子的GFP表达载体在hESC及小鼠胚胎干细胞(mouseembryonicstemcell，mESC)的表达效率，为探索ESC及其衍生细胞移植在体内的存活、迁移、分化及整合提供有力的细胞模型。 方法: (1)依据SteerCV评分标准对D3质量差的胚胎进行评分，通过序贯培养将D3胚胎培养至囊胚，并采用Gardner评分标准进行囊胚评分，观察胚胎评分与囊胚形成率的关系。 (2)用免疫外科的方法去除囊胚滋养细胞，将得到的ICM接种子丝裂霉素C灭活的小鼠胚胎成纤维细胞(mouseembryonicfibroblast，MEF)上培养5～8天，ICM来源的细胞每4～7天传代一次，对hESC碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，AKP)染色、转录因子OCT-4、阶段特异性胚胎抗原(stagespecificembryonicantigen，SSEA)SSEA-4、SSEA-1、肿瘤排斥抗原(tumorejectionantigen，TRA)TRA-1-60、TAR-1-81、核型及体内外分化全能性进行鉴定。 (3)阳离子脂质体转染hESC及mESCES-D3，荧光显微镜下观察阳性克隆，流式细胞术(flowcytometry,FCM)计算不同载体pCX-hrGFP、pIRES-hrGFP在不同种属细胞中的表达效率。 结果: (1)130枚废弃的D3低形态学评分的胚胎培养出囊胚19枚(囊胚形成率14.62％)，总共有10.77％的囊胚在D6天形成满囊胚或扩张胚，3.85％的囊胚在出现囊腔后未继续发育，整个胚胎变成碎片。 (2)用19枚囊胚获得原代克隆5个，成功培养出两株hESC系，它们具有hESC的共同的生物学特性：未分化的hESCAKP,SSEA-4，TRA-1-60，TRA-1-81呈阳性表达；SSEA-1呈阴性表达，分化后呈阳性表达。未分化的hESC脱离饲养层悬浮培养可形成拟胚体，去除饲养层贴壁的hESC可分化为各种形态的细胞，在严重联合免疫缺陷(severecombinedimmunodeficiency，SCID)小鼠体内可形成畸胎瘤。体外分别传代4个月及7个月仍保持正常的核型：46XX、46XY。 (3)两种载体在mESC的表达效率分别为pCX-hrGFP90±2.5％，pIRES-hrGFP0.67±0.02％，两组间比较有显著性差异(p＜0.05)。在hESC的表达效率分别为pCX-hrGFP0.8±0.1％，pIRES-hrGFP0.62±0.08％，两组间比较有统计学差异(p＜0.05)。pCX-hrGFP在mESC及hESC间的表达效率有显著性差异(p＜0.01)，pIRES-hrGFP在mESC及hESC间的表达效率无差异(p＞0.05) 结论: (1)部分形态学评分低的D3废弃胚胎可发育成囊胚。形态学评分与囊胚形成率相关。 (2)形态学评分低的D3废弃胚胎可作为建立hESC库的材料来源之一。 (3)CBA启动子引导的GFP表达效率高于CMV启动子。 (4)同一载体在不同种属细胞内表达效率不同。