玉米是世界上主要农作物之一。随着世界人口的增加,玉米需求持续增长。株型是影响玉米产量的主要因素,主要包括株高、穗位高、叶长、叶宽、叶夹角、雄穗主要性状及茎粗等。因此,通过正向遗传学克隆株型构成因子的相关基因,并通过分子生物学方法阐明目标基因调控性状的分子机制,将有助于玉米株型的遗传改良。本研究在前期控制器官大小基因ZmCSLD1(纤维素合成酶相似蛋白)克隆和玉米叶夹角QTL定位的基础之上,通过遗传学、分子生物学等方法对ZmCSLD1调控玉米器官大小的分子机制进一步解析,并对位于2号染色体上控制叶夹角的主效QTL——qLA2-1进行精细定位,主要研究结果如下:1.本课题组前期克隆了玉米叶宽主效QTL-qLW10的候选基因为ZmCSLD1,该基因编码纤维素合成酶相似蛋白。为进一步验证该基因是否为qLW10的功能基因,本研究利用该基因的Mu转座子插入突变体Zmcsld1W22与三种不同等位变异材料进行等位性测验。与预期一致,相比于野生型,突变体的叶片变窄,证明了ZmCSLD 调控叶宽的变异。2.不同物种ZmCSLD1同源基因的蛋白序列分析表明ZmCSSLD1在进化上相对保守。玉米原生质体瞬时表达表明ZmCSLD1蛋白定位在反式高尔基上。突变体Zmcsld1W22和野生型成熟叶片细胞壁组分分析表明ZmCSLD1在细胞壁多聚糖的合成中起到重要的作用。3.遗传效应分析表明ZmCSLD1具有一因多效的效应,能够影响多个玉米组织器官的大小,且突变后具有一致的抑制器官生长的效应。除此之外,遗传效应分析发现不同等位基因具有不同的效应,这可能是突变位点发生基因的不同位置及基因内互补造成的。酵母双杂实验证明ZmCSLD1蛋白前端1到331氨基酸肽段能够互作,表明ZmCSLD1蛋白以多个亚基互作形成复合体的形式行使功能。4.细胞学观察发现ZmCSLD1突变后导致叶长和叶宽方向细胞数目的急剧下降,而细胞大小显著增加。表达谱分析发现ZmCSLD1在器官细胞快速分裂期表达旺盛,而成熟期基本不表达,且与细胞分裂基因CycB14具有一致的表达模式。这些结果表明ZmCSLD1与细胞分裂相关,可能参与细胞分裂期细胞板的形成。5.对突变体Zmcsld1W22和野生型ZmCSLD1W22 3个发育时期(9B,8B和8M)的叶片进行转录组分析,共检测到827个差异表达基因,其中9B,8B和8M时期分别检测到379,298和396个差异表达基因。功能注释发现共有8个差异表达基因参与细胞壁合成代谢途径。同时,ZmCSLD1突变之后,9B和8B两个时期的叶片单糖、晶体纤维素含量减少,表明ZmCSLD1与细胞壁各组分的合成紧密相关。6.叶片横切片光学显微、透射电镜及叶片表皮扫描电镜观察,发现Zmcsld1W22和Zmcsld1Mo17材料表面具有明显的瘤状颗粒,且该瘤状颗粒为表皮细胞不正常扩展引起。免疫荧光实验发现瘤凸起细胞的细胞壁木葡聚糖含量降低而甘露聚糖含量升高。此外,8M时期9个细胞扩展相关基因在Zmcsld1W22材料中上调表达,可能促进了细胞壁的扩展。因此,ZmCSLD1突变后引起细胞扩展相关基因的响应,进而引起细胞壁多糖组分的改变。7.本课题组前期以玉米大刍草渗入系BC2F5群体为材料,在2号染色体上检测到控制叶夹角的主效QTL——qLA2-1,该QTL能够解释9.16%的表型变异,增加叶夹角的等位基因来自大刍草。在此基础之上,利用包含qLA2-1的家系XM034和XM024对qLA2-1进行效应验证,发现该QTL的大刍草等位基因分别能够增加叶夹角21.36°和 12.16°。分别利用 XM034 材料的 3000 株 BC1F2、4500 株 BC2F2 及 2000 株 BC3F2群体及XM024材料1200株BC1F2材料将qLA2-1定位区间缩小至39kb的范围内,该区间位于ZmLG1上游的基因间区。8.对508份玉米自交系的精细定位区间进行重测序,共检测到424个多态性位点。在0.001水平下,共鉴定到5个位点与叶夹角显著关联,其中2个为SNP变异,3个为小于10bp的插入缺失变异。这些位点当中有4个位点处于完全LD状态。9.对叶夹角近等基因系的叶耳面积、叶耳细胞大小及数目进行统计,发现含有大刍草等位基因的材料叶耳面积显著高于玉米等位基因,这种叶耳面积的差异主要由细胞数目的差异引起。进一步对细胞分裂旺盛时期的叶耳进行ZmLG1表达量分析,发现来自大刍草等位基因能够提高ZmLG1的表达水平,进而增大叶夹角。综上,ZmCSLD1蛋白亚细胞定位在反式高尔基体上,在组织的发育早期表达,突变后影响细胞壁多糖的合成,降低细胞分裂,促进细胞伸展,进而抑制植株各器官的生长。通过精细定位将叶夹角主效QTL——qLA2-1区间缩减到ZmLG1上游的39kb,且证明来自大刍草的等位变异能够上调ZmLG1的表达,促进叶耳细胞数目增多,最终导致叶夹角的增大。