生命科学的快速发展要求人们从单细胞和单分子水平上实现实时、原位、活体地来理解物质之间的相互作用以及生命的过程。近年来,随着激光技术、分子探针制备技术、荧光标记技术、以及弱信号探测技术的不断发展,使得荧光显微镜成为现代细胞生物学研究过程中必不可少的工具。然而由于衍射现象的存在,传统光学显微镜的分辨率被限制在横向200 nm和轴向500 nm左右,还远远达不到生物学研究的需求。近年来,研究人员提出了许多超分辨成像方法,突破了光学衍射极限的限制,大大提高了空间分辨率,使得成像的分辨能力达到了纳米量级。而在活细胞成像过程中,空间分辨率和时间分辨率是相互制约的关系,其中单分子定位的方法就是使用固定细胞成像,以牺牲时间分辨率来获取超高的空间分辨率。而实现细胞内多分子追踪成像,就要求在具有高空间分辨率的同时能够快速的探测到分子的动态过程。单分子追踪方法的提出就为动态追踪成像提供了非常便利的工具,使得生物学家研究细胞、蛋白质、以及生物大分子之间的相互作用和生理过程的现象都成为现实。尽管超分辨成像技术取得了非常巨大的进步,但是在活细胞成像方面仍然存在着许多技术难题亟待突破,例如如何提高系统的成像深度即景深来获得完整活细胞内的动态功能信息。目前,可以实现完整细胞内动态成像的方法主要是基于多焦面显微成像的改进,如利用多焦面衍射光栅实现不同深度的并行成像方法以及利用多个探测器同时对不同深度的样品并行探测实现大景深的成像方法,这些方法在实现过程中由于光能利用率低、系统复杂、成本高等原因难以广泛应用。本论文就是为了解决目前超分辨方法难以实现完整细胞成像方面提出了新的想法,利用具有三维纳米分辨能力的双螺旋点扩展函数与具有扩展景深能力的变形光栅相结合来实现大景深的纳米分辨成像,通过该方法成功获得了完整细胞内高精度的多分子追踪。论文主要工作如下:1.设计与搭建了基于双螺旋点扩展函数的三维定位成像系统。双螺旋点扩展函数是利用系统点扩展函数的改造形成具有连续旋转的双螺旋形式,由其所在位置和旋转角度即可获得相应的三维空间位置,因此该方法是实现三维纳米分辨成像非常有效的方式。论文对DH-PSF进行了理论模拟,并通过优化算法提高了原始DH-PSF的光能利用率,优化后的DH-PSF的光能效率提高了30多倍。利用光刻技术方法制备了高效DH-PSF相位片,并搭建了基于DH-PSF的三维纳米定位成像系统,实现了轴向深度4μm的纳米成像。通过系统标定,实现了横向分辨率10 nm,轴向分辨率20 nm的定位精度,验证了系统用于超分辨成像的可行性。2.设计与搭建了具有双螺旋点扩展函数(DH-PSF)与变形光栅(distorted grating)功能的大景深成像系统(DDCM)。完整细胞的厚度通常是在10μm左右,而单独使用DH-PSF系统还无法满足对完整细胞的三维定位成像,因此需要结合其他的扩展景深的方式来获取。论文提出了变形光栅的扩展方式,它实质上是一个离轴的菲涅尔波带片,结合光栅分光和菲涅尔波带片的透镜作用,可以实现在不同衍射级上引入不同的透镜效应,通过模拟分析变形光栅的成像方式,验证了该方法实现对厚样品不同深度进行成像的可行性。并考虑到原始的振幅型变形光栅光能有效利用率低,而改进形成相位型二元变形光栅,通过对相位台阶的设计可以获得三个衍射级衍射效率相等,提高了光能利用率,利用该方法可以实现扩大景深的要求。为了获得完整细胞内生物分子的动态成像,我们将双螺旋点扩展函数(DH-PSF)与变形光栅(distorted grating)相结合形成复合形式,使其具有DH-PSF三维纳米定位的能力的同时,又具有变形光栅扩大景深的能力,并通过光刻技术获得具有双重功用的复合相位片,并最终搭建了一套大景深的超分辨成像方法(DDCM系统)。通过实验结果显示,该系统具有着很好的定位精度。利用该系统对荧光珠在甘油溶液中的布朗运动进行了追踪成像,根据对荧光珠在甘油溶液中的扩散系数验证了系统的可行性,并通过该系统成功得到了多分子在甘油溶液中的动态追踪结果,为实现完整细胞内分子的动态追踪打下基础。3.开展了活细胞内多分子的动态追踪实验研究。以DH-PSF成像系统和DDCM成像系统为平台开展细胞内分子动态追踪的基础研究。论文选择了巨噬细胞(RAW)和喉癌细胞(HEP-2)为对象,通过两种细胞不同的胞吞机制,对分子跨膜及胞内运动的不同过程进行研究。利用系统成功获取了细胞内多分子的动态追踪,并得到了在分子在细胞内的不同运动模式。本论文工作的创新点是,提出一种实现大景深纳米分辨成像的方法,设计并研制了具有变形光栅和双螺旋点扩展函数功能的复合相位片这一核心器件,扩大显微镜的成像深度,使系统成像景深达12μm。在此基础上,搭建了纳米分辨荧光动态成像系统,解决目前研究中无法实现完整细胞内的多分子动态成像问题。利用该方法无需扫描、层析等方式即可获取细胞内任意位置的纳米分辨动态信息,为生物学家提供了非常有利的工具。