目的:肾间质纤维化(tubulointerstitial,TIF)是各种原因所致肾脏疾病进展至终末期肾功能衰竭的共同病理特征。大量临床病理资料表明,各种原因引起的慢性肾功能损伤与肾小管间质纤维化病变的严重程度较肾小球病变更为密切。所以寻找具有多种治疗作用,在不同途径和阶段拮抗肾间质纤维化形成,无毒或低毒的安全药物对肾脏疾病的治疗有很大的意义。研究表明肾脏小管间质疾病与细胞增殖有关,细胞增殖在肾间质纤维化进程中起重要作用。单侧输尿管结扎模型诱导了严重的小管间质损害,在疾病过程中表现为小管间质细胞增生,间质单核细胞浸润并伴有小管上皮细胞增生和间质肌成纤维(myofibroblast, MyoF)增生。细胞的过度增殖与血管紧张素II(Angiotensin, AngII)及转化生长因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)有关并可被其受体拮抗剂阻断。肾上腺髓质素(adrenomedullin,ADM)是一种新发现的内源性血管活性肽,广泛存在于机体的各个重要脏器和多种组织,其主要的生理功能为扩张血管、降低血压、排钠利尿,在心肾功能调节中发挥重要作用。近期有研究表明ADM具有抑制TGF-β1刺激胶原合成和分泌从而起到拮抗肾间质纤维化的作用,成为国际上的研究热点。中医药在肾脏病的治疗中发挥着很好的作用,动物实验显示活血化瘀中药能抑制血管紧张素II、转化生长因子的表达,减少细胞外基质(extracellular matrix, ECM)的沉积,起到减轻肾间质纤维化的作用,这种作用与其它血管活性肽的参与是否有关尚不清楚,为了证明其可能的作用机制,我们采用肾上腺髓质素基因敲除(adrenomedullin knockout, AMKO)小鼠复制肾间质纤维化实验动物模型,观察在肾上腺髓质素基因缺失状态下细胞增殖的变化,观察与野生小鼠的区别及血管紧张素II受体拮抗剂(angiotensinII receptor blocker, AT1RB)的治疗作用。并给予间质纤维化模型大鼠活血化瘀、软坚散结的鳖甲煎丸(Biejiajian pill, BJJW)进行干预治疗,观察肾上腺髓质素抑制细胞增殖的作用及鳖甲煎丸对其表达的影响,来探讨鳖甲煎丸拮抗肾间质纤维化的可能的作用机理。第一部分细胞增殖在肾间质纤维化野生小鼠肾脏中的作用方法:选用SPE57BL/6J KWL纯系雌性小鼠(WT),体重16-22g,8周龄,适应性喂养一周,测尿蛋白、尿红细胞为阴性者用于实验。随机分为假手术组(WT-Sham)、模型组(WT-UUO)、缬沙坦组(WT-UUOV)三组,每组10只。除假手术组外,各组动物结扎左侧输尿管,术前一天分别灌入生理盐水和药物,于手术后第六天全部小鼠经麻醉后摘取左侧肾脏用4%的多聚甲醛固定,石蜡包埋,行HE及Masson染色进行病理学观察,并分别采用免疫组化及原位杂交方法检测PCNA、TGF-β1、Col III的蛋白及TGF-β1基因水平的表达。TGF-β1、PCNA、Col III、β-actin相对含量用相同PCR反应中光带的强度来衡量mRNA在各种基因应答中的表达。结果1肾组织病理学观察结果HE染色显示:假手术组小鼠肾组织切片未见异常。模型组肾组织切片肾脏皮质和髓质间隙增宽,近曲小管上皮细胞水肿、远曲小管扩张,上皮细胞脱落、坏死及细胞管型形成。缬沙坦治疗组小鼠肾脏病理损伤仍然严重,但优于模型组。Masson染色显示:假手术组小鼠肾脏无异常;模型组小管扩张,小管基底膜变薄,并出现了小管萎缩,间质胶原成分明显增多;缬沙坦治疗组胶原成分增多但较模型组轻。2 PCNA、Col III、TGF-β1免疫组化检测结果PCNA:假手术组小鼠肾组织中有少量PCNA阳性细胞表达;与假手术组相比UUO组小鼠PCNA阳性细胞数明显增加(p﹤0.001),与模型组相比缬沙坦治疗组PCNA阳性细胞数明显减少( p﹤0.001)。III型胶原:假手术组肾组织中仅有微量III型胶原表达,与假手术组相比UUO组在小管间质区III型胶原沉积增多(p﹤0.05);缬沙坦组有III型胶原的沉积但较UUO组轻,与UUO组相比有显著性差异(p﹤0.05)。TGF-β1:假手术组肾组织中TGF-β1在肾小管上皮细胞及肾小球内呈弱阳性表达,其余各组表达显著增强,其中,模型组与假手术组相比显著升高(p﹤0.001);与模型组相比缬沙坦组TGF-β1的表达明显减弱(p﹤0.001)。3 PCNA、Col III、TGF-β1mRNA的表达结果3.1 PCNA、Col III、TGF-β1mRNA的表达UUO组RT-PCR半定量光密度测定结果明显高于假手术组(p﹤0.001,p﹤0.05,p﹤0.001),缬沙坦组与UUO组相比明显降低(p﹤0.05,p﹤0.05,p﹤0.05)。3.2 TGF-β1组织原位杂交结果显示TGF-β1mRNA在假手术组小鼠肾小管上皮细胞及肾小球内呈弱阳性表达,UUO组与假手术组比较明显增强(p﹤0.05),尤其在近曲肾小管上皮细胞胞浆内表达明显,缬沙坦治疗组表达增强但弱于UUO组(p﹤0.05)。第二部分肾上腺髓质素在肾上腺髓质素基因敲除小鼠肾脏细胞增殖中的作用方法:选用肾上腺髓质素基因敲除小鼠(AMKO),雌性,体重16-22g,喂养8周(东京医科大学实验动物中心提供),这些小鼠均是在实验室通过基因定位发生了ADM基因缺失的后代。随机分为假手术组(AMKO-Sham)、模型组(AMKO-UUO)、缬沙坦组(AMKO-UUOV),每组5只。除假手术组外,各组动物结扎左侧输尿管,术前一天分别灌入生理盐水和药物,于手术后第六天全部小鼠经麻醉后摘取左侧肾脏进行病理学观察,并分别采用免疫组化方法检测PCNA、TGFβ1、Col III蛋白表达及分别用组织原位杂交、RT-PCR方法检测TGFβ1和PCNA、TGFβ1、Col III在基因水平的表达。结果1肾脏病理学观察结果HE染色显示: AMKO假手术组小鼠肾脏组织切片表现未见异常,UUO组表现为近曲小管上皮细胞水肿、远曲小管扩张,上皮细胞缺失、坏死及细胞管型形成。缬沙坦治疗组略轻于UUO组。Masson染色显示:假手术组小鼠肾脏无异常;UUO组肾组织切片表现为小管扩张,小管基底膜变薄,并出现了小管萎缩,间质胶原成分明显增多;缬沙坦治疗组胶原成分增多但较UUO组为轻。与WT小鼠相比, AMKO各组小鼠胶原成分明显增多,经缬沙坦治疗有所改善。2 PCNA、ColIII、TGF-β1免疫组化检测结果PCNA免疫组化结果显示:假手术组(AMKO-Sham)小鼠中有少量PCNA阳性细胞表达,但与野生小鼠假手术组(WT-Sham)比较数量增加;AMKO-UUO组小鼠PCNA阳性细胞数与AMKO-Sham相比显著增多(p﹤0.001);经缬沙坦治疗后,PCNA阳性细胞的数量较AMKO-UUO组明显减少(p﹤0.001)。与WT-UUO、WT-UUOV组小鼠相比AMKO-UUO、AMKO-UUOV组小鼠PCNA阳性细胞数增多。III型胶原:AMKO-Sham组小鼠中无表达,模型组(AMKO-UUO)小鼠在小管间质区III型胶原沉积增多(p﹤0.001),基因敲除小鼠UUO组比野生小鼠UUO组III型胶原的表达明显,通过缬沙坦治疗,AMKO-UUOV组的III型胶原沉积较AMKO-UUO组减轻(p﹤0.001)。TGF-β1:结果显示在肾小管上皮细胞及肾小球内呈弱阳性表达,其余各组表达显著增强,其中,模型组与假手术组相比显著升高(p﹤0.01);缬沙坦组TGF-β1的表达较模型组弱(p﹤0.01),肾上腺髓质素基因敲除小鼠各组表达与野生小鼠相比均增强。3 PCNA、Col III、TGF-β1mRNA的表达结果3.1 PCNA、Col III、TGF-β1mRNA的RT-PCR半定量光密度测定结果显示:UUO组明显高于假手术组(p﹤0.05,p﹤0.05,p﹤0.05),缬沙坦组与UUO组相比明显降低(p﹤0.05,p﹤0.05,p﹤0.05)。肾上腺髓质素基因敲除小鼠各组表达与野生小鼠相比均增强。2.2 TGF-β1组织原位杂交结果显示:TGF-β1mRNA在假手术组肾小管上皮细胞及肾小球内呈弱阳性表达,UUO组与假手术组比较明显增强(p<0.05),尤其在近曲肾小管上皮细胞胞浆内表达明显,缬沙坦治疗组表达增强但弱于UUO组(p﹤0.05)。肾上腺髓质素基因敲除小鼠TGF-β1mRNA表达与野生小鼠相比增强。第三部分鳖甲煎丸对肾间质纤维化实验大鼠细胞增殖的影响方法:选用SD大鼠40只,雌性,体重180±10g。适应性喂养一周,测尿蛋白、尿红细胞为阴性者用于实验。随机分为假手术组(Sham)、模型组(UUO)、鳖甲煎丸组(UUOB)、缬沙坦组(UUOV),每组10只。除假手术组外,各组动物结扎左侧输尿管并在术前一天灌胃给药,假手术组与模型组分别灌入等量的生理盐水,共给药14天。于实验第14天全部杀检,实验结束时,断头取血,分离血清;采用苦味酸法、二乙酰—肟法,分别测定血肌酐(SCr)、尿素氮(BUN);取左侧肾脏称重并进行组织病理学观察,取部分肾组织置于70%的乙醇中固定,并送流式细胞检测,测定PCNA阳性细胞蛋白表达量、细胞凋亡及细胞周期。并分别采用免疫组化、RT-PCR方法检测PCNA在蛋白及基因水平的表达。结果1一般情况、肾重/体重、血肌酐、尿素氮检测结果模型组大鼠在手术后体重增长缓慢,毛色差。实验结束时,左侧肾脏体积增大,肾重/体重模型组比假手术组明显增高(p﹤0.001),缬沙坦组及鳖甲煎丸组与模型组比较显著降低(p﹤0.05,p﹤0.05),其中缬沙坦组较鳖甲煎丸组略低,但两组间无显著性差异(p﹥0.05)。血肌酐测定结果显示,模型组明显高于假手术组(p﹤0.001﹚,缬沙坦组、鳖甲煎丸组血肌酐与模型组比较显著降低(p﹤0.001,p﹤0.001﹚,其中鳖甲煎丸组的血肌酐低于缬沙坦组,但无统计学意义(p﹥0.05)。尿素氮测定结果显示,模型组较假手术组明显升高(p﹤0.01),缬沙坦组、鳖甲煎丸组与模型组相比显著降低(p﹤0.01,p﹤0.01﹚,其中鳖甲煎丸组尿素氮低于缬沙坦组,但无统计学意义(p﹥0.05)。2肾组织病理学观察结果HE及天狼猩红偏振光染色结果显示:模型组间质大量炎细胞浸润和纤维组织增生,肾小管部分萎缩、管腔闭塞或扩张,肾小球数目明显减少,面积缩小。肾小囊粘连或扩张,小囊周围大量纤维组织增生。各治疗组间质可见多少不等的炎细胞浸润,少量纤维组织增生,肾小管轻度扩张,部分肾小球轻度萎缩,小囊扩张,肾小球数量无明显改变。图像分析显示:模型组肾间质纤维化程度较假手术组明显加重(P﹤0.001);缬沙坦组、鳖甲煎丸组与模型组比较,肾间质纤维化面积明显减少(P﹤0.001,P﹤0.001),提示鳖甲煎丸及缬沙坦均有拮抗肾间质纤维化的作用。其中,鳖甲煎丸组略优于缬沙坦组,但无显著性差异(p﹥0.05)。3 PCNA免疫组化检测结果结果显示:假手术组大鼠肾组织中有少量PCNA阳性细胞表达; UUO组大鼠PCNA阳性细胞数表达较假手术组显著增多(p﹤0.001),鳖甲煎丸、缬沙坦治疗组较UUO组PCNA表达明显减少(p﹤0.001 ,p﹤0.001),鳖甲煎丸少于缬沙坦组,但两组相比无显著性差异(p﹥0.05)。3 PCNA mRNA的RT-PCR半定量光密度测定结果结果显示:PCNA mRNA的表达UUO组明显高于假手术组(p﹤0.001),各治疗组与UUO组相比明显降低(p﹤0.01,p﹤0.01),其中鳖甲煎丸组低于缬沙坦组,但两组相比无统计学意义(p﹥0.05)。5鳖甲煎丸对UUO大鼠肾脏PCNA阳性细胞蛋白表达量、细胞凋亡和细胞周期的影响5.1各组大鼠PCNA细胞蛋白表达量的改变结果显示:PCNA蛋白表达量模型组较假手术组显著升高(p﹤0.001),而鳖甲煎丸组和缬沙坦组PCNA的蛋白表达量较模型组明显降低(p﹤0.05,p﹤0.05﹚,鳖甲煎丸组PCNA的蛋白表达量略低于缬沙坦组,但两组相比无统计学意义(p﹥0.05)。提示两种药物均有抑制细胞增殖的作用。5.2各组大鼠PCNA细胞凋亡率及凋亡/增殖比值的改变5.2.1 PCNA细胞凋亡率的改变结果显示:PCNA细胞凋亡率在假手术组最低,模型组明显高于假手术组(p﹤0.001),而鳖甲煎丸组和缬沙坦组PCNA细胞凋亡率明显低于模型组(p﹤0.05,p﹤0.05),其中鳖甲煎丸组PCNA的细胞凋亡率略低于缬沙坦组,但两组比较无显著性差异(p﹥0.05)。5.2.2 PCNA阳性细胞凋亡/增殖的比值的改变结果显示:单侧输尿管结扎术后,大鼠PCNA凋亡/增殖的比值模型组较假手术组显著降低( p﹤0.01),鳖甲煎丸组、缬沙坦组较模型组显著升高( p﹤0.05, p﹤0.05),两治疗组比较鳖甲煎丸组略高于缬沙坦组,但两组之间比较无统计学意义(p﹥0.05)。提示两种药物均有促进PCNA细胞凋亡,从而抑制细胞增殖,延缓肾间质纤维化发生的作用。5.3各组大鼠PCNA细胞周期的改变5.3.1 PCNA处于S期的细胞比例比较结果结果显示:PCNA处于S期的细胞比例在假手术组最低,其它各组都较假手术组升高,其中模型组最高,与假手术组比较有显著性差异(p﹤0.001),经鳖甲煎丸、缬沙坦治疗后处于S期的细胞比例较模型组明显降低(p﹤0.05,p﹤0.05),其中鳖甲煎丸组高于缬沙坦组,但两组比较无显著性差异(p﹥0.05)。5.3.2 PCNA处于G0/G1期的细胞比例比较结果结果显示:PCNA处于G0/G1期的细胞比例在假手术组最高,其它各组都较假手术组降低,其中模型组最低,与假手术组比较有显著性差异(p﹤0.001),经鳖甲煎丸、缬沙坦治疗后处于G0/G1期的细胞比例较模型组明显升高(p﹤0.01,p﹤0.01),其中鳖甲煎丸组低于缬沙坦组,但两组比较无显著性差异(p﹥0.05)。5.3.3 PCNA处于G2/M期的细胞比例比较结果结果显示:各组处于G2/M期的细胞比例相比变化不明显,各组相比均无显著性差异。总之,以上结果提示鳖甲煎丸、缬沙坦组两种药物可抑制PCNA细胞有丝分裂,使大量PCNA细胞阻滞在G0/G1期,阻止其由G1期进入S期,从而抑制了细胞增殖。第四部分鳖甲煎丸对肾间质纤维化实验大鼠肾脏TGF-β1、Col III表达的影响方法:选用动物,分组及模型复制,给药方法,标本处理同第三部分,采用免疫组化、RT-PCR方法检测鳖甲煎丸对TGF-β1、Col III在蛋白及基因水平表达的影响。结果1 TGF-β1、Col III免疫组化检测结果1.1 ColⅢ的蛋白表达、分布及半定量分析结果显示:ColⅢ主要表达于肾间质。假手术组大鼠肾间质ColⅢ呈弱阳性表达,其余各组表达显著增强,为条索状或成片块状。其中,模型组与假手术组相比ColⅢ的阳性面积及积分光密度值均显著性升高(p﹤0.001,p﹤0.001);缬沙坦组、鳖甲煎组与模型组相比,ColⅢ的阳性面积及积分光密度值均显著性下降(p﹤0.001,p﹤0.001 ;p﹤0.001,p﹤0.001),提示鳖甲煎、缬沙坦均可抑制梗阻侧肾组织中ColⅢ的蛋白表达,其中,鳖甲煎组优于缬沙坦组,但无显著性差异(p﹥0.05,p﹥0.05)。1.2 TGF-β1的蛋白表达、分布及半定量分析结果显示:假手术组在肾小管上皮细胞及肾小球内TGF-β1蛋白的表达均为弱阳性;其余各组表达显著增强,见于肾小管上皮细胞、间质细胞及肾小球内。其中,模型组较假手术组TGF-β1表达的阳性面积及积分光密度值均呈显著性升高(P﹤0.001,P﹤0.001);缬沙坦组、鳖甲煎组与模型组相比,TGF-β1的阳性面积及积分光密度值均显著性下降(P﹤0.001,P﹤0.001;P﹤0.001,P﹤0.001),提示鳖甲煎丸、缬沙坦均可抑制梗阻侧肾组织中TGF-β1的蛋白表达。其中,鳖甲煎组优于缬沙坦组,但两组相比无显著性差异(p﹥0.05,p﹥0.05)。2 Col III、TGF-β1mRNA的RT-PCR半定量光密度测定结果2.1 Col IIImRNA的表达结果显示:UUO组明显高于假手术组(p﹤0.001),各治疗组与UUO组相比明显降低(p﹤0.05,p﹤0.01),其中鳖甲煎组低于缬沙坦组,但无统计学意义(p﹥0.05)。2.2 TGF-β1 mRNA的表达结果显示:UUO组明显高于假手术组(p﹤0.001),各治疗组与UUO组相比明显降低(p﹤0.05,p﹤0.01),其中缬沙坦组低于鳖甲煎丸组,但无统计学意义(p﹥0.05)以上结果提示鳖甲煎丸、缬沙坦能下调Col III、TGF-β1的蛋白和mRNA的表达,延缓肾间质纤维化的发生。第五部分鳖甲煎丸对肾间质纤维化实验大鼠肾脏肾上腺髓质素表达的影响方法:选用动物,分组及模型复制,给药方法,同第三部分。留取部分新鲜肾组织匀浆,用放射免疫法检测组织中ADM的蛋白含量,其余标本处理方法同第三部分,采用免疫组化、原位杂交和RT-PCR方法检测ADM在蛋白及基因水平表达,观察鳖甲煎丸对其表达的影响。结果1肾组织肾上腺髓质素蛋白含量的测定结果显示:假手术组大鼠肾组织中肾上腺髓质素含量高于模型组(p﹤0.001),鳖甲煎丸组、缬沙坦组的含量较模型组升高(p﹤0.001,p﹤0.05﹚,鳖甲煎丸组肾上腺髓质素的含量高于缬沙坦组,但无统计学意义(p﹥0.05)。2肾组织肾上腺髓质素免疫组化检测结果结果显示:肾上腺髓质素在假手术组表达较为广泛,在皮质及髓质均有表达且以髓质表达为明显,主要表达于肾小管上皮细胞胞浆,UUO组肾上腺髓质素的表达较假手术组明显减弱,在髓质肾小管上皮细胞无阳性表达,仅在皮质部分区域有微弱表达,其阳性表达面积、积分光密度与假手术组比较有显著性差异(p﹤0.001,p﹤0.001﹚;鳖甲煎丸组、缬沙坦组肾上腺髓质素的表达较UUO组明显增强,在皮质及髓质的肾小管上皮细胞胞浆广泛表达,肾小球有微量表达,其阳性表达面积、积分光密度与模型组比较有显著性差异(p﹤0.001,p﹤0.001;p﹤0.001,p﹤0.001﹚,其中,鳖甲煎丸组的表达强于缬沙坦组,但两组相比无显著性差异(p﹥0.05,p﹥0.05)。提示鳖甲煎丸、缬沙坦能上调肾组织肾上腺髓质素的蛋白表达。3 ADM mRNA的表达、分布及半定量分析结果3.1组织原位杂交ADM mRNA的表达结果显示:假手术组主要表达于肾小管上皮细胞胞浆,呈弱表达,但远曲小管稍明显。UUO组表达明显减弱,仅见于近曲小管上皮细胞,其阳性面积及积分光密度值与假手术组相比均呈显著性降低(p﹤0.001,p﹤0.001﹚。鳖甲煎丸组、缬沙坦组肾上腺髓质素的表达的阳性面积及积分光密度值与模型组相比均呈显著性升高(p﹤0.001,p﹤0.001;p﹤0.001,p﹤0.001﹚,远曲小管上皮细胞由于单侧输尿管结扎因素大量脱落而减弱,但近曲小管表达明显增强。鳖甲煎丸组优于缬沙坦组,但两组相比无显著性差异(p﹥0.05,p﹥0.05)。3.2 ADM mRNA的RT-PCR半定量光密度测定结果结果显示: ADM mRNA的表达在假手术组最强,UUO组的ADM mRNA表达较假手术组明显减弱(p﹤0.001),鳖甲煎组、缬沙坦组ADM mRNA的表达较UUO组明显增强(p﹤0.05,p﹤0.05)。鳖甲煎丸组优于缬沙坦组,但两组相比无显著性差异(p﹥0.05)。结果提示鳖甲煎丸、缬沙坦能上调ADM的mRNA的表达。结论本实验采用野生小鼠、肾上腺髓质素基因敲除小鼠和SD大鼠成功复制了肾间质纤维化模型,给与鳖甲煎丸进行治疗并设立缬沙坦对照组,综合分析实验结果,可以得出以下结论:1增殖细胞核抗原可反映间质纤维化进程中细胞的增殖程度,在UUO模型中,其表达明显增强。TGF-β1的蛋白和mRNA的表达明显上调,与细胞增殖密切相关;III型胶原的表达在模型组亦增强,加重了间质纤维化的程度。2血管紧张素II受体拮抗剂缬沙坦能通过阻断血管紧张素II及抑制TGF-β1的过度表达,减轻肾组织的病理损害,减少病变肾组织ECM成分的积聚,延缓肾间质纤维化的进程。3采用肾上腺髓质素基因敲除小鼠复制肾间质纤维化实验动物模型,观察在肾上腺髓质素基因缺失状态下细胞增殖的变化,结果显示肾上腺髓质素在细胞增殖过程中起着重要的作用,能够下调PCNA的表达。4 ADM基因缺失小鼠较野生小鼠纤维化程度更明显,可被血管紧张素II受体拮抗剂缬沙坦部分抑制,说明ADM与缬沙坦的作用有一定交叉,这可能是通过抑制TGF-β1的过度表达而实现的。5 ADM通过抑制诱导TGF-β1而抑制细胞外基质积聚减轻纤维化程度,同时ADM可能通过抑制TGF-β1而抑制细胞增殖表现出对肾脏的保护作用。6鳖甲煎丸可以增加肾组织中的ADM的含量,上调ADM在蛋白及基因水平的表达,并抑制TGF-β1的蛋白和基因表达从而抑制细胞增殖、减少胶原的合成,起到防治纤维化的作用。这可能是中医药治疗肾脏疾病的可能作用机制之一。7流式细胞检测结果提示鳖甲煎丸和缬沙坦诱导PCNA细胞凋亡,可使大量PCNA阻滞在G0/G1期,阻止其由G1期进入S期,从而抑制细胞增殖,延缓肾间质纤维化的发生。