背景:传统意义上,细胞坏死被认为是由极端的物理和化学因素等诱发的细胞死亡方式。然而,近年来的研究表明,细胞坏死并不只是被动的不受调控的。在机体内,某些细胞发生坏死受特定的蛋白激酶RIPK3和MLKL所调控,被称为程序性坏死。迄今为止,对程序性坏死信号通路的研究并不十分明确,有待进一步的分析和研究。目的:基于以上考虑,首先需要构建能快速发生程序性坏死的诱导系统,将程序性坏死关键基因RIPK3与FK506结合蛋白结构域(FKBP)进行融合,通过“Tet-On”系统调控RIPK3的表达,构建可诱导表达RIPK3-2×FKBP的Hela、A549和HT-29稳定细胞系,为深入研究程序性坏死机理等工作提供有力的工具。结果:通过western blot和免疫荧光实验检测发现DOX诱导细胞中RIPK3表达,且1μg/mL DOX就有很好的诱导效果,随DOX诱导时间的延长RIPK3的表达量逐渐升高。加入Idimer后0 h、3 h、9 h,细胞死亡程度加剧且caspase-8抑制剂能够促进DOX和Idimer对细胞的杀伤力。而后通过免疫荧光实验发现DOX诱导RIPK3在Hela细胞质中表达,非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验能够检测到细胞中RIPK3二聚体/寡聚体和MLKL寡聚体形成。进一步的Western blot实验表明DOX和Idimer能够诱导Hela、HT-29和A549细胞三种细胞中的MLKL磷酸化。与对照组DMSO处理的细胞相比,DOX和Idimer处理的Hela,HT-29和A549细胞,最早0.5 h就能检测到MLKL磷酸化。同时,用上述细胞构建NOD/SCID小鼠皮下何瘤模型,通过western blot和组织免疫荧光实验,发现DOX能诱导小鼠肿瘤组织中RIPK3表达和p-MLKL升高。