论文部分内容阅读
第一部分靶向阳离子纳米分子探针的制备及性能检测目的构建叶酸修饰的,阳离子的,包裹液态氟碳(PFP)及吲哚菁绿(ICG)的脂质纳米粒(FA/CN/PFP/ICG,FCNPI),检测其基本性质,相变特性,基因携载能力,靶向性以及生物相容性等。方法本部分研究共有两节。第一节采用双乳化法制备脂质纳米粒,通过在成膜材料中使用叶酸修饰的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DSPE-PEG2000-Folate),及加入DC-胆固醇(DC-cholesterol)使纳米粒表面带有叶酸并带正电荷,从而构建靶向阳离子纳米粒FCNPI,对其形态结构,粒径,电位,ICG包封率等基本性质进行检测;体外使用808nm激光仪激发,观察FCNPI发生相变的情况;并检测其携载质粒的能力,细胞毒性和稳定性。第二节是通过细胞实验和动物实验验证FCNPI的靶向性能。上述实验均同时制备非靶向中性纳米粒(NN/PFP/ICG,NNPI)和非靶向阳离子脂质纳米粒(CN/PFP/ICG,CNPI)与之进行比较。结果本法制备的FCNPI脂质纳米粒为绿色乳液,在扫描电镜下观察发现,其形态为大小均匀的球形,且分散度较好。FCNPI粒径为(328.4±5.5)nm,表面电位为(35.3±1.9)m V。紫外分光光度计的方法测得FCNPI内ICG的包封率为92.1±1.3%。当采用激光辐照(808nm,1W/cm2,2min)后,可见FCNPI纳米粒发生气液相变产生了微泡。基因携载实验结果显示当加入40ug质粒时,靶向阳离子组(FCNPI),非靶向阳离子组(CNPI)和非靶向中性组(NNPI)携载TK-GFP的能力分别是22.4±0.1ug,22.7±0.1ug和16.76±1.75ug(per 5×108nanoparticles),FCNPI和CNPI的基因携载量无统计学差异(P>0.05)。细胞毒性实验表明NNPI、CNPI、FCNPI携载质粒前后细胞活性均在85%以上,且在48h内稳定性良好。在激光共聚焦显微镜下观察发现,在靶向阳离子组(FCNPI),带有绿色荧光的细胞周围附着了许多具有红色荧光的纳米粒,其次是非靶向阳离子组(CNPI),而非靶向中性组(NNPI)和拮抗组均未见到明显的纳米粒与细胞结合的趋势。活体荧光检测显示靶向阳离子组(FCNPI)瘤块区域有最多的荧光,在注射2h后达到高峰,24h逐渐消散,非靶向阳离子组(CNPI)的肿瘤区域仅少许红色荧光,非靶向中性组(NNPI)在观察时间内均未见到红色荧光。24h后取出瘤块再检测荧光,靶向阳离子组(FCNPI)荧光最强,其次是非靶向阳离子组(CNPI),非靶向中性组(NNPI)最弱。结论成功制备出形态规则,大小均匀,性质较稳定,分散性较好,生物安全性良好的靶向阳离子相变型脂质纳米粒FCNPI。该造影剂相变能力和靶向能力均较好,能够运用到下一步实验中。第二部分靶向阳离子纳米分子探针体内外光声/超声显像的实验研究目的观察靶向阳离子纳米分子探针(FCNPI)体外超声、光声效果,研究其作为双模态造影剂的可行性;体内实验了解FCNPI对视网膜母细胞瘤皮下移植瘤超声和光声显像的能力。方法本部分研究分为两节进行。第一节以2%琼脂糖凝胶为载体制备孔洞模型,装载生理盐水(Saline),NNPI(0.5mg/ml),CNPI(0.5mg/ml)和FCNPI(0.5,1.0,1.5,2.0,2.5mg/ml),分别用激光仪(808 nm,2W/cm2)进行1min的辐照,增强超声显像图像采用超声诊断仪获取,平均声强值采用DFY超声图像分析软件获取,从而得到平均声强值和FCNPI浓度的关系。同法以Saline,NNPI(0.1mg/ml),CNPI(0.1mg/ml)and FCNPI(0.1,0.2,0.3,0.4,0.5mg/ml),利用光声成像仪获取不同溶液的光声图像及信号值,分析FCNPI光声信号值与不同浓度的关系。第二节是体内显影实验,建立视网膜母细胞瘤皮下移植瘤模型,将瘤鼠随机分为4组,每组5只。体内超声显像时,经裸鼠尾静脉分别注射Saline、NNPI、CNPI和FCNPI,注射2h后,分别采集激光辐照(808 nm,2W/cm2,2min)前后普通模式和增强显影模式下的超声图像,增强模式下激光辐照前后的声强变化用DFY软件进行测量。体内光声实验中,同样经尾静脉分别注射Saline、NNPI、CNPI、FCNPI,于注射前、注射后1h、2h、6h和12h分别行光声显像,并绘制光声信号随时间变化的曲线图。结果第一节体外超声显像,激光辐照后,普通模式和造影模式下Saline组均无回声,NNPI和CNPI呈高回声,FCNPI回声随其浓度的增加而增强。体外光声成像显示,Saline无光声信号,NNPI和CNPI可见光声信号,FCNPI信号随其浓度的增加而增强。第二节体内超声显像,尾静脉注射后2h观察,激光辐照前,各组在B模式和增强模式下肿瘤区域均未见明显回声。激光辐照后,靶向组(FCNPI)无论在B模式还是增强模式下,裸鼠肿瘤的回声强度都明显高于非靶向组(Saline,NNPI,CNPI)。B模式下Saline和NNPI组较辐照前无明显变化,CNPI和FCNPI组较辐照前明显升高(P<0.01);增强模式下,Saline辐照前后未见明显变化,NNPI较辐照前有所增强,CNPI和FCNPI增强更为显著(P<0.01)。在体内光声成像中,靶向组(FCNPI)在注射后1h,2h,6h和12h均有明显的光声信号,肿瘤局部光声信号强度值明显高于非靶向组(Saline,NNPI,CNPI)。结论FCNPI具备能在体内外实现超声及光声双模态显像的能力,具有成为多功能造影剂的潜能,对视网膜母细胞瘤的诊疗具有潜在的应用价值。第三部分激光辐照靶向载基因的阳离子纳米分子探针,体内外基因转染治疗RB的实验研究目的研究载基因的靶向阳离子纳米分子探针(FCNPI/p DNA)在激光作用下体外转染对Y79细胞的杀伤效应,并探讨靶向基因转染对视网膜母细胞瘤裸鼠皮下移植瘤的治疗效果。方法本部分主要分两节进行。第一节为对Y79细胞的体外转染实验,分为空白组(Control)、单纯质粒组(p DNA)、质粒+激光组(p DNA+Laser)、载基因的非靶向中性纳米粒+激光组(NNPI/p DNA+Laser)、载基因的非靶向阳离子纳米粒+激光组(CNPI/p DNA+Laser)、载基因的靶向阳离子纳米粒+激光组(NNPI/p DNA+Laser),在激光(808 nm,2W/cm2,1min)作用下对Y79细胞进行转染,其转染效率、细胞周期和凋亡情况用流式细胞仪检测,q PCR及Western-blot分别用于测定TK、PCNA、Caspase-3 m RNA及蛋白表达情况,评价载基因的靶向阳离子纳米分子探针(FCNPI/p DNA)在激光促转染后治疗效果。第二节为体内转染实验,建立视网膜母细胞瘤皮下移植瘤模型,造模后14天,随机分为以下八组:Control、NNPI/p DNA、CNPI/p DNA、FCNPI/p DNA、Control+Laser、NNPI/p DNA+Laser、CNPI/p DNA+Laser、FCNPI/p DNA+Laser,激光参数设置为:808 nm,2W/cm2,2min。经不同处理后,每2天观察记录肿瘤生长情况,14天后处死动物,绘制肿瘤生长曲线,通过q PCR及Western-blot分别检测TK、PCNA、Caspase-3 m RNA及蛋白表达情况,同时行H&E染色、TUNEL及PCNA观察肿瘤细胞凋亡及增殖状况。整个过程中用红外成像仪记录监测治疗过程中皮温的变化,并且取各组裸鼠的心、肝、脾、肺、肾做病理切片,评估此基因治疗系统的生物安全性。结果体外转染结果显示24h后,载基因的靶向阳离子纳米粒+激光组(FCNPI/p DNA+Laser)转染率最高,细胞周期抑制在G1期的细胞比例最多,发生早期凋亡的细胞也最多,q PCR和Western-blot均检测到在该组中TK和Caspase-3 m RNA及蛋白表达量最高,而PCNA m RNA及蛋白表达最低;其次是载基因的非靶向阳离子纳米粒+激光组(CNPI/p DNA+Laser)和载基因的非靶向中性纳米粒+激光组(NNPI/p DNA+Laser)。体内治疗结果表明FCNPI/p DNA+Laser组肿瘤生长抑制最为显著,TK和Caspase-3 m RNA及蛋白表达最高,PCNA m RNA及蛋白最低,H&E染色发现肿瘤细胞结构消失,呈红染片状结构,免疫组化结果显示其凋亡指数最高,增殖指数最低;治疗效果明显优于CNPI/p DNA+Laser组和NNPI/p DNA+Laser组;另外五组未见明显的治疗效应。整个治疗过程中,FCNPI/p DNA+Laser组表面皮温升高最明显,但仍低于41℃,不会对组织造成明显的热损伤,各组主要脏器的病理切片均未见明显异常,各组肝肾功能正常,说明此基因治疗系统生物安全性良好。结论载基因的靶向阳离子纳米分子探针(FCNPI/p DNA)在激光作用下基因转染效率最高,体内抗肿瘤治疗效应明显优于非靶向组,可在一定程度上延缓视网膜母细胞瘤皮下移植瘤的生长,有望对视网膜母细胞瘤的治疗开辟新的途径。