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生肌调节因子(myogenic regulatory factors,MRFs)称为MyoD家族,具有一个保守的碱性螺旋-环-螺旋结构(bHLH),包括MyoD(MyoD1,Myf-3)、MyoG(Myogenin)、Myf-5和MRF-4(Myf-6)四种调节因子。本文分离了吉富罗非鱼[Genetic Improvement of Farmed Tilapias(Oreochromis niloticus),GIFT]MyoD1、MyoD2和MyoG的cDNA序列。MyoD1 cDNA全长为1090 bp,阅读框903 bp,编码300个氨基酸;MyoD2 cDNA全长为1478 bp,阅读框792 bp,编码263个氨基酸;MyoG cDNA全长为1599 bp,阅读框753 bp,编码250个氨基酸。氨基酸同源性分析表明,吉富罗非鱼MyoD1与其他鱼类MyoD1的相似性为73%-92%,与鱼类MyoD2的相似性为62%-65%,与哺乳动物MyoD的相似性为63%-64%;MyoD2与其他鱼类MyoD2的相似性为74%-79%,与鱼类MyoD1的相似性为59%-62%,与哺乳动物MyoD的相似性为58%-59%;MyoG与其他鱼类MyoG的相似性为73%-95%,与哺乳动物MyoG的相似性为57%-59%。系统发育树显示,MyoD1、MyoD2和MyoG分属三支,MyoD1和MyoG所反映不同鱼类之间的亲缘关系基本符合传统的分类,而MyoD2至今只在部分鱼类(刺鳍总目)中发现。以β-actin为内标的荧光实时定量RT-PCR结果显示,MyoD1、MyoD2和MyoG在肌肉中高表达,在脑、心脏,肝脏、肾脏和性腺等组织微量表达,为进一步研究MyoD家族的功能奠定基础。
分离了吉富罗非鱼MyoD1、MyoD2和MyoG的内含子序列,并分析了奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼之间内含子上的差异,奥利亚罗非鱼MyoD1的2个内含子和MyoG的内含子1均比尼罗罗非鱼长,差异明显,相比之下MyoD2的2个内含子和MyoG的内含子2差异不明显。根据MyoD1内含子2的差异建立了鉴别奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼基因混杂的标记,为选择基因纯合的奥利亚罗非鱼和尼罗罗非鱼提供了分子手段。
运用直接测序法对吉富罗非鱼MyoD1、MyoD2和MyoG的SNPs(SingleNucleotide Polymorphisms)位点进行筛选,共获得MyoD17个SNPs位点,其中1个位于外显子1,其余均在内含子上;MyoD2外显子1有个1个SNPs位点;MyoG中未找到SNPs位点.构建PCR-RFLP法检测MyoD1外显子1 A324G和内含子1 T471C在192尾吉富罗非鱼中的基因型,并分析了不同基因型与生长性状的相关性。外显子1 A324G转换导致AccⅡ酶切位点的改变,使用PCR-RFLP法检测该位点的基因型,结果显示整个实验群体不存在GG型,AG和AA的基因型频率在雌鱼中分别为0.19和0.81,在雄鱼中分别为0.24和0.76;与生长性状的相关性分析表明,各基因型在体型、增重方面都无显著差异(P>0.05)。内含子1 T471C转换导致 AluⅠ酶切位点的改变,使用使用PCR-RFLP法检测该位点的基因型,结果显示,CC、CT、TT基因型频率在雌鱼中分别为0.08、0.38、0.54,在雄鱼中分别为0.07、0.30、0.63;与生长性状的相关性分析表明,各基因型在体型、增重方面都无显著差异(p>0.05).本文所筛选的吉富罗非鱼MyoD12个SNPs位点在进一步的家系选育过程中,与生长性状的相关性分析以及其他SNPs位点的检测需进一步研究。