目的:在真菌性角膜炎发病过程中,致病真菌的直接损伤和宿主的免疫反应两方面共同对角膜组织造成破坏。中性粒细胞在机体抵抗真菌的免疫反应中起关键作用,可通过多种机制直接杀伤真菌,也可以表达多种模式识别受体,启动免疫反应,参与介导多种信号转导通路及下游炎症因子释放。中性粒细胞应对外来微生物感染首先做出的反应是产生活性氧(Reactive oxygen species,ROS),而NADPH氧化酶(NADPH oxidase,NOX)家族是体内吞噬及非吞噬细胞中ROS的主要来源。NOX可以跨膜传送电子,将氧分子转变为超氧化物,通过调节细胞内的氧化应激状态来发挥多种生理学功能。NOX家族中NOX2亚型对宿主抗微生物反应十分关键,一旦NOX2活性受损,ROS的产生受到抑制,人类和动物会对致病的细菌和真菌高度易感,并且出现过度的炎症反应,说明NOX2在抗感染和炎症调节中发挥了关键作用。NOX2对机体抵御烟曲霉菌感染有着特异性的作用,中性粒细胞杀灭烟曲霉菌是依赖NOX2的,阻断NOX2后,机体对烟曲霉菌菌丝的杀伤能力显著降低。已有研究证实角膜组织中存在NOX2的表达,但是关于NOX2在烟曲霉菌感染角膜炎中是否发挥作用目前并无相关报道,本文建立小鼠烟曲霉菌性角膜炎模型,探讨NOX2在其中的表达,然后利用抑制剂对其进行抑制,从而研究NOX2在该病中发挥的作用,最后探讨其发挥作用的通路,从而全面了解NOX2在烟曲霉菌性角膜炎中所发挥的作用。方法:1、酪蛋白刺激法提取C57BL/6小鼠腹腔中性粒细胞进行分离培养,烟曲霉菌灭活菌丝悬液刺激后PCR及Western blot法检测感染后各时间点NOX2的表达变化。烟曲霉菌菌丝感染小鼠制作真菌性角膜炎模型,收集正常与感染后1天、3天、5天小鼠角膜组织,PCR、Western blot及免疫荧光染色方法检测正常组和感染后角膜中NOX2的表达变化。2、小鼠结膜下注射不同浓度的NOX2抑制剂Diphenyleneiodonium chloride(DPI),PCR及Western blot法验证DPI对NOX2的抑制效果及适宜的抑制浓度;DPI预处理腹腔中性粒细胞,PCR法及Western blot法验证DPI对NOX2的抑制浓度及效果。建立单纯真菌感染组、NOX2抑制组及溶剂对照组小鼠真菌性角膜炎模型,拍照记录各组角膜炎1天、3天、5天的病变情况,统计各组临床评分,观察DPI处理对角膜炎炎症反应程度的影响;体内体外实验检测NOX2的存在对ROS产生的必要性,流式细胞术检测抑制NOX2后角膜组织真菌感染后ROS的表达变化,免疫荧光染色法观察抑制NOX2后中性粒细胞真菌刺激后ROS的表达变化;真菌刺激后,中性粒细胞胞外陷阱(Neutrophil extracellular traps,NETs)形成时组蛋白H3释放,因此检测H3的量可以大体代表NETs的形成量,分别进行体内体外两种实验,ELISA法观察真菌刺激后角膜组织及中性粒细胞培养上清液中H3的表达变化以评价DPI对NETs形成的影响;收集真菌感染后角膜组织,行菌落计数实验观察抑制NOX2后对真菌清除能力的影响;免疫荧光染色法及MPO法检测抑制NOX2对小鼠角膜组织中中性粒细胞数目的影响;PCR法检测抑制NOX2后小鼠角膜中Nrf2、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-10、TGF-βmRNA的表达变化,ELISA法观察角膜组织TNF-α的变化;适应性免疫方面,PCR法检测抑制NOX2后小鼠角膜中IL-17AmRNA的表达变化,Western blot法检测IL-17A蛋白水平的变化。3、收集小鼠腹腔中性粒细胞,分别用Dectin-1抑制剂昆布多糖(Laminamin)、SYK抑制剂PRT062607、PKC-δ抑制剂Rottlerin预处理后,烟曲霉菌菌丝悬液刺激细胞,PCR法检测各组中NOX2的表达变化,Western blot法检测各组中NOX2、Dectin-1、SYK、p-SYK及PKC-δ蛋白的表达变化。结果:1、NOX2在小鼠烟曲霉菌性角膜炎中的表达(1)C57BL/6小鼠提取腹腔中性粒细胞烟曲霉菌灭活菌丝悬液感染12小时后PCR检查可见NOX2 mRNA水平开始显著增高,20小时达最高峰,24小时略有下降(p<0.01,p<0.01,p<0.01)。真菌刺激中性粒细胞后24小时,NOX2蛋白水平表达明显增加。(2)PCR法检测C57BL/6小鼠烟曲霉菌感染角膜后NOX2 mRNA的表达,正常角膜中NOX2含量较少,感染后角膜中NOX2 mRNA的表达水平较正常组及空白对照组明显升高,感染后第1天、第3天、第5天NOX2mRNA水平持续升高,差异具有统计学意义(p<0.05,p<0.01,p<0.01)。Western blot法结果可见正常角膜中NOX2蛋白表达量较少,感染建模后1天、3天、5天角膜NOX2蛋白水平表达明显升高。免疫荧光染色结果示:正常角膜组织中阳性染色极少,感染烟曲霉菌3天时角膜上皮层及基质层中可见NOX2阳性染色明显增多,越靠近感染部位,阳性染色越重。2、NOX2在小鼠烟曲霉菌性角膜炎中的作用(1)中性粒细胞分离培养之后,DPI组中加入不同浓度的DPI培养液预处理半小时,可见真菌刺激组加溶剂DMSO未下调NOX2的表达,同该组相比,各组浓度(1μM、5μM、10μM)的DPI均可以显著下调NOX2的表达(p<0.01,p<0.01,p<0.01)。选用浓度为1μM的DPI预处理中性粒细胞后真菌刺激24小时,同溶剂对照组相比可明显下调NOX2蛋白表达。(2)不同浓度的DPI溶液(0.1μM、0.5μM、1μM)球结膜下注射法处理小鼠,感染后3天各组角膜中NOX2 mRNA的表达结果显示,同溶剂对照组中相比,浓度为1μM的DPI溶液可以抑制真菌感染后角膜组织中NOX2mRNA的表达(p<0.01)。浓度为1μM的DPI溶液预处理后可以显著抑制感染后角膜组织中NOX2蛋白的表达。(3)小鼠随机分为单纯真菌刺激组、真菌刺激+DPI处理组和真菌刺激+DMSO对照组,对比角膜炎症反应程度可见DMSO对照组病变反应程度与单纯真菌感染组大致相似,而DPI处理组在同一时间点与另外两组相比,角膜溃疡面积大,混浊程度和周边角膜水肿重,新生血管也明显增加,角膜临床炎症评分明显增高,差异具有统计学意义(p<0.01,p<0.05,p<0.01),且同未抑制NOX2时角膜炎症反应在3天最重、5天时开始减轻相比,NOX2被抑制后感染5天的病变程度明显重于3天,病变呈现逐渐加重的趋势。(4)流式细胞术检测感染后24小时角膜组织中ROS阳性的细胞比例,可见同对照组相比,DPI处理抑制NOX2后,ROS阳性比例明显下降(p<0.01)。体外实验检测抑制NOX2对小鼠中性粒细胞中ROS产生的影响,可见真菌感染后ROS染色增加,同对照组相比,经DPI处理抑制NOX2后ROS阳性细胞明显减少。(5)体内体外两种实验检测抑制NOX2前后组蛋白H3的表达量变化,均可见真菌感染后H3含量显著上调(p<0.01,p<0.01),DPI处理后H3量明显低于对照组(p<0.01,p<0.05)。(6)抑制NOX2后对小鼠角膜进行菌落计数实验,可见同单纯真菌感染组相比,DPI处理后菌落形成的数量明显增多(p<0.05)。(7)DPI抑制NOX2后,NIMP-R14标记角膜组织中的中性粒细胞,可见同真菌感染组相比,DPI处理组染色阳性细胞明显增多。MPO活性检查可见真菌感染后角膜组织MPO值明显高于对照组(p<0.01),DPI处理后MPO值明显高于溶剂对照组(p<0.05)。(8)烟曲霉菌感染后,小鼠角膜中Nrf2、NF-κB、TNF-α、IL-6、IL-10、TGF-βmRNA炎症因子的表达均显著升高(p<0.05,p<0.05,p<0.01,p<0.01,p<0.05,p<0.05);溶剂DMSO对照处理未对炎症因子的释放产生影响;同对照组相比,DPI处理可使Nrf2、IL-10、TGF-βmRNA水平下调(p<0.05,p<0.01,p<0.05),而NF-κB、TNF-α、IL-6 mRNA表达水平上调(p<0.05,p<0.05,p<0.05)。TNF-α蛋白的表达变化结果相似,烟曲霉菌感染后TNF-α蛋白的表达升高(p<0.01);DPI处理后,TNF-α蛋白水平较对照组增加(p<0.05)。(9)烟曲霉菌感染后IL-17A mRNA的表达升高(p<0.05),DMSO处理对IL-17A的表达没有影响。同对照组相比,DPI处理可使IL-17AmRNA进一步增加(p<0.05)。真菌刺激后IL-17A蛋白表达增加,DPI处理可使其进一步增加,同溶剂对照组相比有统计学意义。3、NOX2在小鼠烟曲霉菌性角膜炎中表达的通路Dectin-1抑制剂昆布多糖、SYK抑制剂PRT062607、PKC-δ抑制剂Rottlerin分别预处理小鼠腹腔中性粒细胞后真菌刺激,可见三种抑制剂处理均可下调真菌刺激后NOX2mRNA及蛋白水平的表达(p<0.01,p<0.01,p<0.05)。Western blot法可见单纯真菌刺激后各组中Dectin-1、p-SYK、PKC-δ表达量上调,昆布多糖可抑制NOX2、Dectin-1、p-SYK、PKC-δ的表达,PRT062607可抑制NOX2、p-SYK、PKC-δ的表达,Rottlerin可抑制NOX2、PKC-δ的表达。结论:烟曲霉菌感染C57BL/6小鼠角膜后NOX2表达上调,抑制NOX2后角膜炎症反应加重,可通过减少ROS的产生和NETs形成来限制对真菌的直接杀伤能力,同时可影响中性粒细胞清除、调控Nrf2通路、下游炎性因子的分泌及Th17型细胞反应来实现对角膜炎症反应程度的控制。NOX2的表达需通过Dectin-1--SYK--PKC-δ通路。NOX2在小鼠烟曲霉菌性角膜炎的炎症反应进程中发挥着关键的作用。