目的:内皮祖细胞(Endothelial Progenitor Cells,EPCs)由来源于机体骨髓、外周血等部位的单个核细胞分化而来,可分裂增殖成为成熟的血管内皮细胞,因此能够促进血管的新生并具有强大的损伤血管修复功能。目前,糖尿病血管病变已成为影响人类健康的一个重要威胁,而对糖尿病所致的血管病变发病机理的大量研究表明,该过程中EPCs的凋亡起着明显的作用。细胞凋亡是细胞由自体基因调控的,自主的、程序性的死亡过程,当各种原因导致EPCs内钙、磷水平急剧升高,则可导致细胞凋亡并形成凋亡小体。晚期糖基化终末产物(Advanced Glycation End products,AGEs)是指机体内的脂质、蛋白质以及核酸等游离基于无酶作用条件下,自发的与各种还原单糖反应所生成的稳定、不可逆转的共价结合物,是高糖环境下诱导细胞凋亡的主要物质,正常的生理状态下AGEs几乎不表达,而在糖尿病患者中AGEs的表达明显增加,从而导致了一系列的病理过程。而这一过程中细胞体内众多的生物传导信号通路均参与其中,尤其是丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated Protein Kinases)MAPKs即为其中最重要的一组信号通路,有研究报道称抑制氧化应激反应(Oxidative Stress)同时亦可抑制AGEs诱导的EPCs凋亡。因此本实验主要通过观察体外AGEs是否通过氧化应激激活MAPK信号通路从而诱导大鼠骨髓源性EPCs凋亡及其具体的机制。方法:采用脱臼SD大鼠颈椎的方法处死SD大鼠,后于75%酒精中浸泡消毒20分钟。消毒后将SD大鼠置于紫外线照射后的超净工作台中,使用解剖器械分离大鼠胫骨及股骨,完成分离后,采用含有1%肝素的无菌PBS液冲洗股、胫骨骨髓腔直至骨髓腔变成无色透明为止,将冲洗液收集,高速离心机离心后小心收集离心管底部细胞,采用Ficoll密度梯度离心法培养和分离大鼠骨髓源性单核细胞,成功分离出单核细胞后,采用清洁巴氏管吸取细胞悬液后均匀滴于6孔板之中,初次换液为3天,后换液时间为每隔3-4天,使用倒置显微镜定期观察细胞形态变化,并使用激光共聚焦显微镜鉴定经Di I-ac LDL和FITC-UEA-1双荧光染色的EPCs。采用流式细胞仪检测经不同浓度的AGEs(50ug/l、100ug/l、200ug/l)以及200ug/l浓度AGEs干预处理不同时间(6h、12h、24h、48h)后EPCs的凋亡率,后采用Western Blot检测不同浓度及不同时间对EPCs中凋亡蛋白Bax及凋亡抑制蛋白Bcl-2的表达以及JNK和P38MAPK信号通路磷酸化产物的活化情况;使用分子探针(DCFH-DA)检测200ug/l浓度AGEs干预处理不同时间(3h、6h、12h、24h)后EPCs中活性氧簇(Reactive Oxygen Species)ROS的表达量;NAC(抗氧化剂)预处理EPCs1h后使用200ug/l AGEs干预24h后检测ROS表达的含量以及Bax蛋白相对表达量;为进一步证明P38MAPK和JNK在EPCs凋亡具体机制中的作用,分别使用经典的JNK抑制剂SP600125(20um)和P38MAPK的抑制剂SB203580(20um)干预EPCs1h后,采用Western Blot检测促凋亡蛋白Bax、凋亡抑制蛋白Bcl-2和JNK、P38MAPK磷酸化产物的活化情况。结果:将骨髓中的单个核细胞成功分离后,采用EGM-2完全培养基于专用细胞孵箱中培养3天后观察,见70%以上的EPCs贴壁,并呈圆形,少有呈椭圆形、梭形或纺锤形,孵箱继续培养至第7天后,镜下可见EPCs生长迅速,此时观察已可见细胞初步呈集落样生长,以上细胞再次培养至14天后,再次镜下观察可发现细胞出现典型“铺路石”样、漩涡样生长。后为明确所培养细胞为EPCs,取出孵育7天后的EPCs进行鉴定,采用DIL-ac LDL与FITC-UEA-1“双吞”实验,使用共聚焦显微镜观察、鉴定细胞,经DIL-ac LDL染色后EPCs表现为红色荧光,而EPCs结合了FITC-UEA-1后则表现为黄色荧光,红黄荧光双染色细胞被证明为EPCs。所有细胞经干预之前均采用不含血清的基础培养基“饥饿”处理24h。后分别予以不同浓度梯度(0ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml)AGEs-BSA干预、刺激EPCs24h后,凋亡细胞比率随着AGEs浓度的增加而进行性升高,凋亡率分别为5.94%、9.83%、24.81%,以及200ug/ml浓度AGEs-BSA分别经不同时间点刺激(6h、12h、24h、48h)细胞凋亡呈时间依耐性增加,但24h时为顶峰,凋亡率分别为15.83%、22.75%、27.86%、23.24%,促凋亡蛋白Bax相对表达量同样也呈时间、浓度依耐性增加(24h时达到顶峰),而凋亡抑制蛋白Bcl-2相对表达量则呈时间、浓度依耐性降低。同时Western blot检测P-P38MAPK、P-JNK、T-P38MAPK、T-JNK蛋白含量的表达,随着AGEs-BSA浓度(0ug/ml、50ug/ml、100ug/ml、200ug/ml)的升高P-P38MAPK、P-JNK的相对表达量呈浓度相关性增加(分别为P-P38MAPK,0.28±0.01、0.33±0.01、0.41±0.02,vs Medium组,P<0.01,n=3;P-JNK 1.08±0.02、1.36±0.01、1.75±0.01,vs Medium组,P<0.01,n=3)。而随着时间的变化P-P38MAPK在24h内呈时间相关性增加,24h时相对表达量达到顶峰后逐渐下降,P-JNK相对表达量在12h内呈时间相关性增加,12h时达到顶峰后逐渐下降,无论是时间还是浓度的变化,T-JNK和T-P38MAPK的表达量均没有发生任何变化。经过DCFH-DA检测200ug/l浓度AGEs干预处理不同时间(3h、6h、12h、24h)后EPCs中ROS的表达量,可见随着时间的增加EPCs内ROS含量的生成亦呈上升趋势(DCFH-DA荧光的相对表达量分别为114.41%、119.49%、131.36%、128.32%vs Medium组,P<0.01,n=3),于12h时达到顶峰,后逐渐下降。而在加入抗氧化剂NAC过后,ROS的产生、Bax凋亡促进蛋白含量的表达均明显下降DCFH-DA相对荧光值明显减少为98.21%vs133.51%(p<0.01,n=3),而Wester Blot检测Bax蛋白含量的表达明显降低(0.86±0.01vs0.24±0.01,P<0.01,n=3),同仅采用200ug/ml AGEs-BSA干预的对照组比较,具有显著的统计学意义(P<0.01)。在加入JNK抑制剂(SP600125,20um)后,同浓度为200ug/ml AGEs刺激组相比Bax、P-JNK表达明显减少(分别为0.95±0.01vs 0.40±0.01,P<0.01,n=3;1.05±0.01vs 0.25±0.01,P<0.01,n=3),而Bcl-2的表达明显增加(0.19±0.01vs0.59±0.01,P<0.01,n=3)。在加入p38MAPK的抑制剂SB203580(20u M)预处理后,同浓度为200ug/ml的AGEs-BSA刺激组相比Bax、P-p38MAPK表达明显减少(分别为0.95±0.01vs0.29±0.01,p<0.01,n=3;0.80±0.01vs0.41±0.02,P<0.01,n=3),Bcl-2表达明显增加(0.19±0.01vs0.62±0.01,p<0.01,n=3),同样T-JNK及T-P38MAPK没有发生变化。结论:1.AGEs可促进EPCs内氧化应激反应的产生从而诱导EPCs的凋亡;2.AGEs通过P38MAPK/JNK信号通路诱导EPCs的凋亡。