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第一部分 鼻咽癌放射敏感性相关血清学microRNAs的筛选背景与目的:鼻咽癌是广西最常见的恶性肿瘤之一。由于鼻咽癌解剖位置的特殊性及其对放射治疗敏感的特点,放射治疗仍是治疗鼻咽癌的首选治疗方法。近年来,随着放射治疗设备、放射治疗技术、放射物理学和放射生物学的发展,鼻咽癌的治疗效果得到了进一步的改善。但是临床上常见同期别鼻咽癌患者采用相同的放射治疗技术、相同的放射治疗剂量,仍有部分患者出现照射野内复发,其主要原因考虑与肿瘤对放射线的抗拒性有关。因此,放疗前准确预测鼻咽癌患者的放射敏感性,为患者制定更合理的个体化放治方案显得尤为紧迫。本课题组在前期对鼻咽癌细胞株放射敏感性机制方面的研究基础上,拟结合不同放射敏感性鼻咽癌患者血清标本,通过miRNA(microRNA,微小RNA)基因芯片技术筛选与鼻咽癌患者放射敏感性特异相关的miRNAs,构建鼻咽癌放射抗拒相关miRNAs的差异表达谱,为临床上寻找可用于评估鼻咽癌放射抗拒性的“生物标记物”、阐明鼻咽癌放射抗拒产生的分子机制奠定基础。本研究的完成对预测鼻咽癌放射敏感性并开展鼻咽癌的个体化治疗具有重要的指导意义和广阔的应用前景。方法:(1)收集12例不同放射敏感性鼻咽癌患者的血清标本,包括放射敏感鼻咽癌患者7例,放射抗拒鼻咽癌患者5例。所有患者均严格按照入组标准入组,血液采集均在未接受任何治疗之前进行,采血后静置离心,收集血清,分装后做好标记,置于-80℃冰箱保存。(2)然后进行基因芯片杂交实验,提取两组患者血清标本中的RNA作为基因芯片杂交实验的材料,检测两组样本中miRNAs的表达水平,进行归一化处理,筛选两组患者之间差异表达的miRNAs;(3)采用miRWalk 2.0在线软件预测差异miRNAs的靶基因,采用R语言ClusterProfiler包对预测的差异靶基因进行GO(Gene Ontology,基因本体论)、KEGG(Kyoto EncyclopediaofGenes and Genomes,京都基因与基因组百科全书)Pathway注释富集分析,预测差异miRNAs靶基因参与的功能分类和信号通路。结果:(1)两组不同放射敏感性鼻咽癌患者的血清样本通过基因芯片筛选出具有显著差异性表达(Foldchange>2,Pvalue<0.05)的miRNAs共37个。与放射敏感组相比,放射抗拒组中有19个miRNAs表达量上调,18个miRNAs表达量下调。(2)采用miRWalk2.0在线软件预测差异miRNAs的靶基因,给出了 12种miRNA靶基因预测程序的预测结果,筛选给出至少被6种程序预测到的结果,共计8824个。(3)对差异miRNAs预测的靶基因进行生物信息学分析,可知其参与的生物学过程主要有Ras蛋白信号转导、轴突生成、轴突发育等,细胞组分主要富集在细胞前沿、突触后膜、突触后专门化;分子功能主要富集在DNA结合等方面;富集最显著的三条通路依次是MAPK信号通路、轴突导向、癌内蛋白聚糖;富集最显著的三种疾病分别是恶性胶质瘤、器官系统良性肿瘤、结缔组织肿瘤。结论:本研究通过基因芯片技术筛选出不同放射敏感性鼻咽癌患者血清学相关差异miRNAs共37个,初步构建了放射抗拒鼻咽癌血清中miRNAs差异表达谱。第二部分 鼻咽癌放射敏感性相关血清学MicroRNAs的鉴定背景与目的:在前期研究中,本课题组通过基因芯片技术筛选出了与鼻咽癌放射敏感性相关血清学差异miRNAs共37个,其中相对于放射敏感组有19个miRNAs表达量上调,18个miRNAs表达量下调。然而基因芯片存在一定概率的假阴性或假阳性,为了进一步验证基因芯片结果的可靠性,有必要选取部分差异显著的miRNAs进行实时荧光定量逆转录聚合酶链式反应(reverse transcription-quantitative real time PCR,RT-qPCR)实验验证,以评价血清中的miRNAs作为预测鼻咽癌放射敏感性生物标志物的可行性,为将来进一步研究鼻咽癌放射抗拒产生的分子机制及实施个体化的诊疗提供理论依据。方法:采集不同放射敏感性鼻咽癌初治患者治疗前的血清,采用RT-qPCR验证部分基因芯片筛选的差异miRNAs(hsa-miR-1281、hsa-miR-1825、hsa-miR-6732-3p、hsa-miR-6865-3p)的表达水平是否存在差异。为了检验差异表达的miRNAs对鼻咽癌放射敏感性的预测价值,本研究进一步采用了ROC(Receiver Operating Characteristic)曲线及曲线下面积(Area under the Curve of ROC,AUC)进行分析。结果:通过RT-qPCR验证实验,我们发现hsa-miR-1281、hsa-miR-6732-3p在放射抗拒组鼻咽癌患者血清中的相对表达水平低于放射敏感组鼻咽癌患者,差异有统计学意义(P<0.05),与基因芯片检测结果一致。hsa-miR-1281 的 AUC 为 0.737(95%CI:0.556-0.917,P=0.028),灵敏度和特异度分别为 87.5%、57.1%;而 hsa-miR-6732-3p 的 AUC 为 0.692(95%CI:0.501-0.883,P=0.074),灵敏度和特异度分别为 56.3%、85.7%。hsa-miR-1281 和hsa-miR-6732-3p联合诊断鼻咽癌患者放射敏感性的准确性(AUC=0.741,95%CI:0.561-0.921,P=0.025)高于单独用 hsa-miR-1281 或 hsa-miR-6732-3p进行诊断的准确性。结论:(1)RT-qPCR实验验证结果表明hsa-miR-1281诊断鼻咽癌患者放射敏感性时诊断能力中等,具有一定的准确性,而hsa-miR-6732-3p诊断鼻咽癌患者放射敏感性的能力较低。(2)由于血清取材方便,而且相对无创,因此,将血清中的hsa-miR-1281和hsa-miR-6732-3p作为评估鼻咽癌放射敏感性的生物标志物具有潜在的应用价值,不过其可靠性还需进一步在更大样本人群中进行验证。