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目的:优化电喷雾技术用以构建包埋骨髓间充质干细胞(hBMSCs)的海藻酸钠-明胶(Alg-Gel)水凝胶微球,并将这种生物活性细胞微球植入3D打印聚己内酯(PCL)支架中增殖和分化,形成具有较好的生物相容性和机械稳定性的组织工程软骨结构生物支架。同时,利用人肌腱干/祖细胞(hTSPCs)和I型胶原(COLI)与顺磁性氧化铁纳米微粒(IOPs)混合在磁场中诱导生物各向异性COL I-IOPs-hTSPCs水凝胶,促进干细胞增殖和成肌腱方向分化潜能,以期将成果应用于组织工程再生医学重要组织器官损伤的早期修复。方法:首先优化电喷雾技术以生物制造海藻酸钠-明胶-骨髓间充质干细胞(Alg-Gel-hBMSCs)水凝胶微球,从对微球的多分散性、生产效率和尺寸圆度的分析比较来确定生物制造的标准化流程。利用BioCAD和3D打印机设计制作并打印出特制三维结构PCL支架。实验分组为:海藻酸钠-干细胞水凝胶微球2D孔板培养组(Alg-hBMSCs+2D),海藻酸钠-明胶-干细胞水凝胶微球2D孔板培养组(Alg-Gel-hBMSCs+2D),海藻酸钠-明胶-干细胞水凝胶微球3D打印PCL支架培养组(Alg-Gel-hBMSCs+PCL+2D)和海藻酸钠-明胶-干细胞水凝胶微球3D生物反应器培养组(Alg-Gel-hBMSCs+3D)。分别进行干细胞活性和增殖情况的定性和定量检测,成软骨分化能力的检测以及实验末点的支架力学强度分析。同时,使用肌腱组织中最为丰富的COLI包埋hTSPCs,混合IOPs在磁场中诱导产生生物各向异性,IOPs首先被均一线性排列。实验分组为:单纯I型胶原混合干细胞组(COL I-hTSPCs),I型胶原混合入干细胞及无规则排列(Random)IOPs组(COL I-R/IOPs-hTSPCs)和诱导出生物各向异性的均一线性排列(Aligned)IOPs组(COL I-A/IOPs-hTSPCs)组。分别分析各时间点的水凝胶收缩情况,干细胞活性和增殖能力,IOPs和hTSPCs在水凝胶中的各向异性随着实验进展的改变和对比,细胞形态的比较以及共48个成肌腱方向相关基因和谱系/交联相关基因的表达分析。结果:制定出最优化电喷雾技术标准化流程,即10×106/mlhBMSCs包埋在1.5%w:v海藻酸钠-0.5%w:v B型明胶微球中,在8kV/0.6bar的电压/气压值下使用内径为0.150mm的喷射针头(30G)和3%w:v的CaCl2固化液,制造出完整的、稳定的,具有较窄的尺寸范围分布和良好球体形状的水凝胶微球。与单纯海藻酸钠-干细胞微球相比,海藻酸钠-明胶-干细胞微球更能有效提高接种后hBMSCs的活性和增殖能力(p<0.05)。Alg-Gel-hBMSCs水凝胶微球在3D打印PCL支架中和在3D生物反应器中培养的增殖情况更加优于上述两组2D孔板中培养(p<0.05)。与此相似,DNA含量、GAG含量和GAG/DNA比值,以及II型胶原(COL Ⅱ)基因和聚蛋白多糖(ACAN)基因的表达,Alg-Gel-hBMSCs+PCL+2D组和Alg-Gel-hBMSCs+3D组也均明显高于其他两组(p<0.05),而这两组的COLI基因的表达虽然随着实验进展也在不断上调,但在各个时间点均明显低于2D孔板培养组(p<0.05)。生物各向异性研究结果显示,剥离后悬浮生长的COLI水凝胶收缩情况非常严重,其在第一天体积缩小量可达80%之高(p<0.05),而附着于培养皿的COL I水凝胶在整个实验周期中未发生收缩。具有生物各向异性IOPs均一线性排列的COL I-A/IOPs-hTSPCs组从第3天起就具有明显更高的细胞增殖能力(p<0.05),且该组细胞的形态更加狭长,细胞横轴/纵轴比在第7天明显小于其他组(p<0.05),表现出类似于梭形肌腱细胞的形态。从细胞骨架染色图像中还可看出,COL I-A/IOPs-hTSPCs组hTSPCs逐渐被A/IOPs诱导和其同向均一线性排列,至第7天时其程度更加明显,而A/IOPs则随着实验进展其程度有所下降,甚至在第7天时已不及hTSPCs。此外,该组细胞纵向首尾相接串联形成细胞链,其数目和每个细胞链中融合的细胞个数均高于其他组。所有的基因表达在第3天各组间均没有显著差异(p>0.05),至第7天,成肌腱相关基因ACTA2、THBS4、TNC、TGF β1,肌腱相关胶原蛋白基因COL1A1、COL6A1,转录因子基因SCX和胶原蛋白交联基因BGN、FN的表达第三组均明显高于前两组(p<0.05),成肌腱相关基因mRNA水平上调5至7倍,前两组基因的表达在第3天和第7天则无明显差异(p>0.05)。结论:电喷雾法制备的Alg-Gel微球具有良好的生物相容性,可很好地促进干细胞的增殖。与Alg微球相比,Alg-Gel使hBMSC的生物活性和增殖水平更高,并更加支持和促进软骨形成。在自行设计的3D打印PCL支架上植入组装含有干细胞的水凝胶微球和在3D生物反应器中组的生化分析和基因表达的结果表明,其hBMSC的增殖水平更高,成软骨分化潜力更大。利用IOPs在磁场作用下诱导COLI生成生物各向异性水凝胶并装载hTSPCs能明显促进hTSPCs均一线性排列和生长,使其梭形形状更加狭长,并促进细胞的纵向首尾相连形成条丝状细胞链,使其具有更高的细胞活性和增殖能力,在分化方面具有更高的向成肌腱方向分化的能力,为结合生物各向异性和组织工程技术早期修复重要组织器官损伤的临床应用开辟新的思路,提供理论支持和临床转化前景。