固有免疫对于机体抵御致病微生物的侵害是非常重要的。巨噬细胞作为固有免疫反应中发挥关键作用的效应细胞,负责对感染的快速识别以及对致病微生物进行清除。固有免疫系统主要是通过模式识别受体(Pattern-recognition receptor,PRR)对病原体中广泛存在的特定分子结构即病原体相关分子模式(Pathogen-associated molecular pattern,PAMP)完成特异性的识别。PRR 通过 PAMP进而启动下游级联信号传导程序来清除病原体。Toll样受体(Toll-like receptor,TLR)是一种进化上保守的PRR,对于识别和消除病原体具有非常重要的作用,TLR可以辨别来自不同病原体的PAMPs。TLRs识别PAMPs后,触发一系列信号激活核转录因子NF-кB促使巨噬细胞等固有免疫细胞分泌趋化因子和炎性因子,启动固有免疫应答进行宿主防御。因此,TLR在固有免疫应答中起着至关重要的作用。然而,异常的TLR信号也会导致炎症反应异常和众多的免疫性疾病,败血症就是其中之一,这是一种以持续过度炎症和免疫抑制为特征的病理综合症,具有很高的发病率和死亡率。尽管目前对败血症中关键的发病机制的了解已大大增加,但在临床上仍缺乏完全有效的治疗方法。为此,探究TLR信号的作用机制,避免TLR信号的异常活化意义重大。Cullin 4B(CUL4B)蛋白是 Cullin-4B Ring E3 连接酶复合物(CRL4B)中的支架蛋白,通过针对特定底物进行泛素依赖性降解或修饰来参与调节各种生理和发育的过程。在人群中,CUL4B突变导致X连锁智力低下综合征,病患除了智力障碍外,还表现出单核细胞数升高等其他缺陷,提示CUL4B可能在单核巨噬细胞功能方面有作用。我们实验室近期的研究结果显示,CRL4B复合物协同转录抑制复合物PRC2促进H3K27三甲基化(H3K27me3),抑制一系列抑癌基因的转录并促进肿瘤的发生发展,另一方面CRL4B复合物通过协同PRC2及HDAC复合物转录抑制磷酸酶PP2A与PHLPP1/2进而调控AKT/β-catenin信号通路,这些结果说明CUL4B参与表观遗传调控。目前,表观遗传修饰已被证明对于感染和病原体引起的免疫响应具有关键的调节功能。同时,随着TLR信号调控网络的日渐完善,表观遗传修饰在众多TLR诱导基因转录调控过程中的作用逐渐显现。而CUL4B复合物作为一个转录抑制因子是如何参与TLR相关的免疫信号途径的尚不清楚。基于上述事实,本课题通过髓系细胞特异性敲除Cul4b基因小鼠对CUL4B在TLR介导的固有免疫应答中的作用及其机制进行了研究。第一部分CUL4B缺失促进TLR介导的炎症反应本部分主要利用病原体诱导的小鼠疾病模型探究CUL4B在TLR介导的固有免疫应答中的作用,并取得以下结果。1.成功构建了特异性敲除髓系细胞Cul4b的小鼠(Myeloid cell specific KO,MKO)。利用流式检测小鼠的各种髓系细胞组成,发现Cul4b缺失不影响小鼠的脾脏和骨髓中的单核细胞、巨噬细胞、树突细胞以及中性粒细胞的比例与数量。2.LPS诱导BMDM,qRT-PCR分析细胞炎性因子的水平,结果表明在TLR2/3/4的配体诱导以后,MKO的BMDM中Tnfα、Il1β、Il6以及Ifnβ的mRNA表达量高于WT的BMDM,说明CUL4B缺失促进TLR2/3/4配体诱导的炎性因子表达。3.TLR2/3/4的配体诱导后,MKO的BMDM分泌到培养基中的炎性因子如TNF-α、IL-1β、IL-6以及IFNβ明显高于WT的BMDM分泌的炎性因子。4.分别给予小鼠脂多糖(LPS)刺激和鼠伤寒沙门氏杆菌(SL1344)感染,模拟革兰氏阴性菌感染造成的败血症休克,并通过检测小鼠血液中TNF-α、IL-1β和IL-6,分析血液细菌容量和小鼠生存率来分析CUL4B敲除对巨噬细胞中TLR信号的影响。我们发现,在LPS以及革兰氏阴性菌造成的小鼠败血症症模型中,MKO小鼠具有更严重的炎症反应和更高的死亡率。5.小鼠体内实验,TLR3的配体poly(I:C)诱导小鼠感染,对小鼠外周血中炎性因子TNF-α、IL-6以及IFNβ的含量进行了检测并且统计分析了两种基因型小鼠的生存率。实验结果表明MKO小鼠血液中TNF-α、IL-6以及IFNβ的含量明显多于WT小鼠,并且MKO小鼠的死亡率也明显高于WT小鼠。综合以上结果,小鼠髓系细胞缺失CUL4B加重了 TLR3/4配体诱导的炎性因子分泌和感染性休克。因此CUL4B负调控TLR2/3/4介导的固有免疫应答。第二部分CUL4B通过抑制GSK3β活性调控TLR2/3/4介导的免疫应答上一部分结果,我们发现CUL4B缺失促进TLR信号诱导的固有免疫反应,那么其发挥调控作用的分子机制又是怎样的呢?研究表明GSK3β是多种TLR信号通路中促炎细胞因子产生的关键调控分子,GSK3β抑制剂可以有效抑制促炎细胞因子的产生,并促进抗炎性因子IL-10的产生。尽管这些研究清楚地证明了 GSK3β在TLR介导的细胞因子产生中的重要性,但是GSK3β活性的调节机制知之甚少。实验室前期结果显示CRL4B可以调控GSK3β活性。那么,CUL4B负调控TLR2/3/4介导的免疫应答是否是通过调控GSK3β实现的呢?为此,我们进行如下分析:1.我们首先检测了 CUL4B缺失对LPS诱导的GSK3β活性的影响,发现CUL4B敲除的巨噬细胞在响应LPS诱导时下调GSK3β的S9位磷酸化水平,提示巨噬细胞CUL4B敲除后GSK3β的激酶活性显著提高。2.与LPS诱导结果一致,CUL4B敲除的BMDM在响应poly(I:C)或者PGN诱导时GSK3β S9位磷酸化水平显著低于WT巨噬细胞,这些结果表明在TLR2/3介导的固有免疫信号中CUL4B缺失增强GSK3β激酶活性。3.为了验证上述观点,我们利用GSK3β抑制剂对LPS或poly(I:C)诱导的小鼠进行拯救实验,发现GSK3β抑制剂能明显缓解休克模型中MKO小鼠的症状、降低死亡率。4.研究显示GSK3β可以增强NF-кB转录活性而抑制CREB的转录活性。因此,我们采用报告基因和Western分析方法检测了缺失CUL4B对巨噬细胞NF-кB和CREB转录活性的影响。发现敲除髓系细胞CUL4B导致NF-кB的转录活性增强,而CREB的转录活性降低,进而减少了抑炎因子IL-10表达。综上所述,CUL4B通过抑制GSK3β活性进而调控TLR2/3/4介导的固有免疫应答反应。第三部分CUL4B通过抑制Pten转录负调控TLR2/3/4介导的免疫应答第二部分我们发现CUL4B通过抑制GSK3β活性调控TLR2/3/4诱导的固有免疫反应,那么CUL4B是如何调控GSK3β活性的呢?为此,我们进行了以下分析:1.GSK3β(S9)的磷酸化受AKT催化,我们首先检测了缺失CUL4B对AKT活性的影响。发现AKT的两个活性位点Thr308、Ser473的磷酸化水平在TLR2/3/4配体刺激下MKO巨噬细胞中都显著低于对照小鼠巨噬细胞;2.分析催化AKT磷酸化和去磷酸化的激酶和磷酸酶发现,敲除CUL4B并不影响巨噬细胞这些酶的表达水平;3.进一步分析发现CUL4B敲除后AKT的负调控因子PTEN显著升高,而且CUL4B对PTEN的调控发生在转录水平;4.利用染色质免疫共沉淀实验(ChIP)确定了 CUL4B在Pten启动子区域的结合位点,而且发现TLR2/3/4刺激导致CUL4B在Pten启动子区域的结合减少。qChIP分析显示CUL4B缺失导致PRC2复合物的主要成分EZH2在Pten启动子区域的结合减弱,H2AK119ub1和H3K27me3富集程度显著降低,而激活转录的H3K4me3显著增加。提示CRL4B协同PRC2复合物抑制Pten转录。上述结果在机制上解释了 CUL4B复合物通过抑制Pten转录进而限制GSK3β的活性,避免了 TLR介导的固有免疫反应持续活化,保持免疫稳态。同时这一研究将表观遗传修饰与固有免疫相互联系,进一步丰富了对固有免疫应答信号的认识,为败血症等病原体引起的免疫系统疾病的预防和治疗提供了一个新的潜在靶点。