研究背景和目的肿瘤转移播散一直是肿瘤治疗研究中的一大难题。肿瘤细胞从原发灶脱离,侵入间质,内渗进入血管,随血流到达远处器官组织定植,继续增殖成瘤,多器官受累加速患者死亡。单就结直肠癌而言,50%的癌灶会发生远处转移。结直肠癌导致的患者死亡,90%是由于肿瘤的转移播散引起。肿瘤血管生成是肿瘤转移过程中的关键性事件,抑制肿瘤血管生成能显著地抑制肿瘤的生长和转移。抗肿瘤血管生成是不同于常规抗肿瘤治疗的新策略。血管内皮生长因子(VEGF)及其受体调控途径则是肿瘤血管形成的核心因素。在结直肠癌的发展过程中,VEGF的作用尤为突出。VEGF在结直肠癌组织中表达水平显著高于癌旁正常粘膜,且表达水平与肿瘤大小显著相关。高表达的VEGF不但促进肿瘤血管新生,而且与结直肠癌的浸润深度、淋巴结转移、远处转移和Dukes分期呈正相关。VEGF受体家族广泛表达于瘤细胞及间质血管内皮细胞,进一步说明VEGF及其受体信号通路促进结直肠癌的发展和转移。近年,针对VEGF及其受体的靶向治疗已经成为抗肿瘤治疗的重要策略。如人源化VEGF单抗bevacizumab,其联合化疗药物常被用作治疗转移性结直肠癌的一线方案。另外还有可抑制VEGFR酪氨酸激酶的药物sunitinib和sorafenib等microRNA在人体组织中广泛表达,对30%的编码基因行使调节功能,对增殖、分化、死亡等基本细胞过程具有重要的调控作用。近期,在多种肿瘤中发现有不同microRNA的异常表达,说明特异性的microRNA与肿瘤发生有密切联系。它们可能扮演致癌基因或者抑癌基因的角色,这取决于它们作用的靶基因。一些具有促癌或者抑癌作用的microRNA连同它们的靶基因已经相继被鉴定出来。例如,在结直肠癌中,miR-143的表达降低是KRAS持续激活并促进恶性转化的重要原因；niR-135则可以抑制APC的表达,异常激活WNT通路。这可能是除APC基因突变以外存在的另一种APC失调的情况。作为明确的促癌因子,VEGF是microRNA的调控靶点。1niR-126可以通过抑制SPRED1、PIK3R2,解除二者对VEGF信号途径的抑制,促进胚胎血管形成并维持管壁的完整性。VEGF可以增加miR-296的表达,靶向抑制HGS,解除其对PDGFR和VEGFR2的抑制,提高VEGF的作用效率,促进肿瘤血管生成,形成一个正反馈路径。这些研究均提示,microRNA对以VEGF及其受体为中心的肿瘤血管生成过程具有重要的调控作用,调节某些特异性microRNA的表达可能成为抗VEGF治疗的新手段。我们在前期的生物信息学分析中发现,VEGF是miR-126的预测靶基因。本研究希望通过体外实验鉴定直肠癌中miR-126—VEGF这一靶向调控关系的存在,并进一步探讨：niR-126表达缺失的原因,及其对VEGF介导的结直肠癌肿瘤血管生成和转移过程的调控机制。研究方法和结果1.miR-126在结直肠癌中的表达异常降低采用Taqman探针荧光定量PCR法检测了12对结直肠癌组织以及6种结直肠癌细胞株中成熟1niR-126的表达水平。结果显示,肿瘤组织中的miR-126表达水平与其相应的癌旁正常粘膜相比,均显著下降。其在6种细胞系中的表达水平也显著低于正常对照(P<0.05)。2.恢复结直肠癌细胞中miR-126的表达水平能够抑制VEGF的表达采用Iipofectmin2000转染miR-126的precusors进入LoVo和SW620细胞株,以恢复miR-126的表达。Western blot结果显示,与阴性对照相比,肿瘤细胞中miR-126表达水平恢复后,VEGF的表达受到了显著抑制。但RT-PCR的结果中却没有发现VEGF的mRNA表达水平变化有统计学差异。提示这种抑制作用可能是在蛋白翻译水平产生的。3.miR-126通过与VEGF mRNA3’UTR结合而直接调控VEGF表达生物信息学预测在VEGF mRNA3’UTR中含有一个可与：miR-126互补结合的位点。我们分别构建了含有野生型和突变型结合位点序列的荧光素酶报告基因(VEGF3’UTR/mut VEGF3’UTR),(？)将它们和miR-126的precursors或者scramble共转染进入HEK293细胞中,检测细胞的荧光素酶活性。共转染miR-126precursors/VEGF3’UTR的HEK293细胞,其荧光素酶活性显著低于共转染niR-126scramble/VEGF3’UTR的细胞,而共转染miR-126precursors/mut VEGF3’UTR则可以抵消共转染miR-126precursors/VEGF3’UTR引起的荧光素酶活性降低。此结果说明,miR-126确实是通过与VEGF mRNA的3’UTR直接结合,从而遏制VEGF的蛋白翻译过程。4.恢复miR-126表达可抑制结直肠癌细胞的迁移及侵袭能力,但不影响其增殖利用alarmar blue法检测LoVo和SW620细胞恢复miR-126表达后细胞的增殖能力变化。实验分组为：未处理组(blank)、阴性对照组(scramble)和处理组(pre-miR-126),每组分别检测细胞转染处理后24h、48h和72h三个时间点的细胞活性。结果显示,转染处理后的72h内,不同处理组的LoVo或SW620细胞之间,其增殖能力均未出现差异变化(P>0.05)。提示miR-126并不参与结直肠癌细胞的增殖调控。运用Transwell实验,检测结直肠癌细胞在1niR-126表达水平恢复后,其细胞运动能力,即迁移能力和侵袭能力的改变。处理分组同增值实验,细胞转染处理24h后,将细胞消化重悬加入Transwell装置上室(侵袭试验上室预铺基质胶Matrigel),下室为含20%FBS的新鲜培养基。培养48h后,计数上室滤膜下表面的细胞数。结果显示,恢复miR-126后的结直肠癌细胞,其迁移和侵袭能力相比未处理和阴性对照处理组均显著减弱(P<0.05)。5.恢复miR-126的表达能够抑制结直肠癌细胞通过分泌VEGF诱导的肿瘤血管形成转染precusors恢复LoVo细胞中miR-126的表达水平,在转染后48h取细胞培养基检测其中VEGF的浓度。结果在10nM、30nM和30nM的转染浓度下,LoVo细胞培养基中的VEGF浓度3.61±0.08ng/ml、3.05±0.08ng/ml和2.68±0.11ng/ml均显著低于未处理组(blank)的4.12±0.18ng/ml和阴性对照组(scramble)的3.99±0.10ng/ml(P<0.05)。内皮细胞迁移实验中,在transwell体系中将人微血管内皮细胞(HMVEC)和经过转染处理的LoVo细胞共培养24h后,计数上室滤膜下表面的细胞数。结果显示,与恢复了miR-126表达的LoVo细胞(pre-miR-126)共培养的HMVEC细胞,其迁移能力显著低于与未处理组(blank)和阴性对照组(scramble)LoVo细胞共培养的HMVEC细胞(P<0.05)。体外的小管形成实验中,在LoVo细胞转染后的48h,收集未处理组(blank).阴性处理组(scramble)和口处理组(pre-miR-126)的细胞培养基,用以重悬HMVEC细胞,以0.5×104/well数量将HMVEC种入预铺Matrigel基质胶的96孔板中37℃孵育细胞12h,显微镜下计数HMVEC形成的完整封闭的环状结构。结果表明,处理组培养基刺激HMVEC细胞形成小管的能力显著地弱于未处理组和阴性处理组。进一步利用鸡胚绒毛膜尿囊实验模型评估niR-126表达水平对于体内肿瘤血管生成能力的影响。以无菌明胶海面为载体,分别携带各组上述收集到的培养基,将载体置于鸡胚绒毛尿囊膜血管稀疏部位,计算以载体为中心向四周放射状生成的毛细血管数,以此评价血管新生能力。结果与体外实验结果近似,处理组培养基(pre-miR-126)刺激鸡胚血管新生的能力显著弱于未处理组(blank)和阴性对照组(scramble)(P<0.05)。6.启动子甲基化是结直肠癌中miR-126的表达缺失的重要原因采用MSP方法检测结直肠癌组织中miR-126启动子区的甲基化修饰情况。被检测的62例结直肠癌组织中,有50例在miR-126启动子区有甲基化修饰存在。而对6种结直肠癌细胞株的MSP检测结果则显示,6种细胞株均受不同程度的甲基化修饰。进一步的BSP测序结果与MSP结果符合,各细胞株miR-126启动子区CpG岛内的CG二核苷酸均有较高频率地甲基化修饰。使用甲基转移酶抑制剂5-aza-CdR处理六种细胞株,使其启动子区去甲基化后收集细胞,利用real time-PCR检测miR-126的表达情况,并用western blot检测VEGF的表达变化。结果发现,经去甲基化处理后,各细胞株中miR-126的表达水平均有显著提高,而随着miR-126表达的上调,VEGF (?)勺表达也受到相应抑制。提示启动子区的甲基化是使得结直肠癌中miR-126表达异常降低甚至缺失的重要原因,并且是结直肠癌中VEGF表达异常增高的原因之一。结论本研究证实了miR-126在结直肠癌中可以靶向调控VEGF。 miR-126通过与VEGF mRNA3’UTR中的互补位点结合,在翻译水平抑制VEGF的表达。miR-126在结直肠癌中表达异常降低或缺失。启动子区的甲基化修饰是miR-126表达降低的重要原因。恢复miR-126的表达可以抑制结直肠癌细胞的迁移和侵袭能力,并且通过抑制肿瘤细胞分泌VEGF而抑制肿瘤血管的生成。因此,miR-126是一个抗肿瘤转移和血管生成治疗的潜在靶点。