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本文利用水稻抗稻瘟病近等基因系和特异性稻瘟病菌株构成不同亲和程度的互作关系,稻瘟病菌采用传统的叶片喷雾接种和菌液直接根系接种两种侵染途径,结合信号传导物质水杨酸(SA)、茉莉酸(JA)及其生物合成途径抑制剂的应用,通过RT-PCR、Real-Time PCR、信号传导途径中关键酶活性检测等方法,研究了稻瘟病菌不同侵染途径的侵染作用、信号物质作用及其相关抑制剂的作用下,在不同亲和互作关系中,水稻叶片和根系中3个信号传导途径关键酶合成基因、5个防御反应病原相关蛋白基因(OsPR)、1个防御反应转录因子调控基因(OsMyb)、1个蛋白酶抑制剂基因(OsBBPI)和1个信号传导网络中关键节点基因(OsNH1)的诱导表达特异性,诱导表达的时序性和在不同组织里诱导表达的系统性。本研究还探讨了稻瘟病菌在水体中直接侵染根系,对水稻叶片和根系中与抗病性、信号传导途径直接有关的苯丙氨酸解氨酶和脂氧合酶活性的影响。研究结果表明:
1.稻瘟病菌叶片侵染,水稻叶片信号传导途径关键合成酶基因、病原相关蛋白基因和其它防御反应基因的诱导表达与稻瘟病菌互作的亲和程度有关。稻瘟病菌从叶片侵染,在不同互作反应中诱导了水稻叶片脂氧合酶基因(OsLOX),丙二烯氧化物合成酶基因(OsAOS)和苯丙氨酸解氨酶合成基因(OsPAL)的表达,同时启动了SA和JA防御反应信号传导途径。OsMyb基因在各种互作反应中有不同的诱导表达。叶片接种后OsPR1a、OsPR2、OsPR3-1和OsPR3-2基因在不亲和互作反应中诱导表达水平高,表达持续的时间较长。因此,在稻瘟病菌侵染过程中水稻植株合成并累积了较高水平的防御反应PR蛋白,使水稻表现为抗病性。在亲和互作反应中,上述病原相关蛋白基因的表达水平低、时间短或没有表达,植株表现为感病。
2.稻瘟病菌根系侵染直接诱导了水稻根系和间接系统地诱导了水稻叶片中信号传导途径关键酶等防御反应基因的表达。稻瘟病菌从根系侵染水稻后,直接诱导了不同互作关系中根系OsLOX,OsAOS和OsPAL基因的表达,不仅在根系中直接启动了SA和JA防御反应信号传导途径以抵御稻瘟病菌侵染,而且还通过水稻自身的防御反应体系,诱发了叶片中OsLOX,OsAOS和OsPAL基因的表达,在抵御稻瘟病菌侵染中间接系统地启动了叶片JA和SA介导的防御反应信号传导途径。同时,系列OsPR、OsMyb和OsBBPI基因除了在根系中被直接诱导表达外,因启动了信号传导途径而在叶片中也被系统地诱导表达。不亲和互作关系的根系和叶片中OsLOX,OsAOS基因表达量强于高度亲和互作关系的品系,基因表达具有特异性。因此,稻瘟病菌从根系侵染后,水稻根和叶都启动了SA、JA信号传导途径,诱导了防御反应基因的表达以抵御稻瘟病菌的侵染。
3.稻瘟病菌叶片侵染能系统诱导水稻根系中OsLOX、OsAOS、OsPAL基因的表达,在根系中启动了由JA、sA介导的两条甚至是两条以上防御反应信号途径。OsPR、OsMyb和OsBBPI基因也因信号途径的系统启动,而在非直接侵染的根系中被系统地诱导。它们在表达量上和时序上因亲和互作程度不同而有明显差异,如OsPR1a、OsPR2、OsPR3-1和OsPR3-2基因在不同亲和互作中的诱导表达具有特异性。同一基因的诱导表达有时序性变化特点,在不同组织里的诱导表达有系统性。OsMyb和OsBBPI基因,无论在叶片或根系中被系统诱导,还是在根系或叶片中被直接诱导,其表达丰度都相对较高,对稻瘟病菌侵染诱导敏感,在不同亲和互作反应中的诱导表达也表现为特异性、时序性和系统性。因此,稻瘟病菌无论从叶片侵染还是从根系侵染,水稻根系和叶片的信号途径关键酶合成基因、诱导型的防御反应基因都能直接和间接地被诱导表达,表现为水稻诱导防御的系统性。
4.根系和叶片两种侵染途径,无论是直接诱导还是间接诱导,信号传导途径关键酶基因、病原相关蛋白基因和其它防御反应基因在叶片中的诱导表达水平总体上远高于在根系中的诱导表达水平(根系目的基因在RT-PCR、Real-Time PCR 扩增时比叶片扩增多5个循环),即水稻叶片中防御反应基因mRNA的转录丰度比根系中的转录丰度要高得多。
5.稻瘟病菌M209根系侵染、SA及其SA合成途径抑制剂DPI等单因素、双因素处理,对水稻根系和叶片OsPAL、OsPR3、OsPR4、OsMyb和OsNH1基因诱导或抑制表达的时序性、特异性和系统性有明显影响,这种诱导或抑制与基因表达所依赖的信号传导途径直接有关。SA根系处理,对依赖于JA信号传导途径的OsMyb基因诱导没有显著差异,OsPR3和OsPR4诱导效果多数不显著,但对根系中依赖于SA信号途径的OsPAL、OsNH1基因直接诱导则具有显著差异,同时对叶片中的OsPAL、OsNH1基因间接系统诱导效果也达显著水平。M209根系接种24 h后对OsPR3、OsPR4等基因诱导效果显著。SA+M209双因素处理对OsPAL、OsNH1基因诱导效果比单独处理更明显,诱导效果具有累加作用。DPI具有诱导和抑制的双重性,对依赖SA信号途径的基因有抑制作用,对由JA介导的基因有间接的诱导效果。DPI处理对根系和叶片OsPAL基因表达有抑制作用,抑制效果多数不显著;对根系和叶片OsPR3和OsPR4基因有诱导作用,诱导效果多数不显著;对OsMyb基因表达有较显著的诱导作用。DPI对SA生物合成途径有所阻断,相当于间接启动JA途径,从而对OsPR3、OsPR4和OsMyb基因具有诱导作用。DPI对OsNH1基因有抑制效果,而DPI+M209复合处理对OsNH1 基因有不显著的诱导作用。
6.JA及其JA生物合成途径抑制剂SHAM、M209根系侵染等单因素、双因素处理,对水稻根系和叶片OsPAL、OsPR3、OsPR4、OsMyb和OsNH1基因具有诱导表达或抑制表达的作用。M209、JA+M209、SHAM+M209根系处理对OsPAL和OsNH1基因诱导效果显著,SHAM+M209复合处理对OsNH1基因诱导效果比单独处理的诱导效果更明显,存在互作效应。JA、M209、JA+M209根系处理对根和叶OsPR3和OsPR4基因分别有显著的直接和间接诱导效果。SHAM处理对根和叶OsPR3和OsPR4基因表达有抑制作用,平均抑制效果分别为21.9%和18.9%,均未达显著水平。JA、M209,SHAM等处理对OsMyb基因的诱导或抑制影响与对OsPR3和OsPR4基因的作用效果相似。
7.稻瘟病菌从根系侵染水稻近等基因品系C039(亲和)与C101LAC(不亲和),对水稻根系和叶片中与防御反应直接有关的苯丙氨酸解氨酶(PAL) 和脂氧合酶(LOX)活性有明显影响。稻瘟病菌根系侵染可诱导两种互作反应根系中PAL 和LOX酶活性的变化,也能间接系统地诱导叶片中PAL和LOX酶活性的改变。在亲和与不亲和互作中,PAL和LOX酶活性的变化有明显差异。不亲和互作的根系和叶片中PAL酶活性升高快,24 h时达到高峰。亲和互作的。PAL 酶活性高峰出现晚,48 h时才达到相对较低的峰值。在两种互作反应中的根系和叶片PAL酶活性表现趋势相同。LOX酶活性变化总体上与PAL酶活性变化趋势一致。在亲和与不亲和的两种互作反应中,根系中PAL和LOX酶的活性值远低于叶片中的PAL和LOX酶活性值。稻瘟病菌从根系侵染,系统诱导了稻苗酶活性的改变,启动了水稻植株的系统抗病性,从而使根系和叶片中的PAL和LOX酶活性提高,而且在酶活性水平和动态变化上还呈现出规律性。稻瘟病菌根系侵染,使水稻启动了SA和JA两条主要信号传导途径,诱导了关键酶基因OsPAL和OsLOX的表达。由OsPAL和OsLOX基因主要调控的PAL、LOX酶活性也发生了相应的变化,并表现为根系侵染后PAL、LOX酶的可诱导性和诱导的系统性以及根系和叶片中的特异性,同时还表现出酶活性在强度上和时序上的差异。稻瘟病菌从根系侵染,在水稻根系和叶片中所产生的这些差异,最终体现在水稻近等基因品系与稻瘟病菌所构成的亲和与非亲和互作关系上的差异。