目的:白杨素（5,7-二羟基黄酮,chrysin,Chr）作为中药黄酮类化学成分,具有抗氧化、抗炎、抗菌和抗病毒等多种生物学功效,但因其水不溶性而导致体内吸收差和5、7位羟基在体内被迅速糖基化代谢导致活性较低,限制了该药物的临床应用。自微乳化释药系统（self-microemulsion drug delivery system,SMEDDS）是近年来研究较多的一种纳米释药系统,其既可改善难溶性药物的溶解度、增加药物淋巴转运,提高口服生物利用度和稳定性,又可拓宽了药物的使用人群,且易于大规模生成,为大量水溶性差的化学药物和中药活性成分口服吸收提供了一种新的给药途径。本课题对白杨素自微乳化释药系统（Chr-SMEDDS）的理化性质、制备表征、体内外吸收及体内药效学进行研究,并从细胞和分子水平上对其口服吸收机制进行分析,旨在提高其溶解度,改善药物的吸收,为白杨素的新型口服制剂开发和临床应用提供研究基础,以及为SMEDDS的研究发展提供实验依据。方法:1.Chr体外含量测定分析方法的建立;采用摇床法对Chr在不同介质中的平衡溶解度进行测定;采用经典摇瓶法测定Chr的油水分配系数;利用紫外分光光度法测定Chr的解离常数,为后续Chr-SMEDDS的制剂研究提供理论依据。2.采用单因素实验法,以自微乳化时间为评价指标,分别考察搅拌速度、温度、稀释介质和稀释倍数对SMEDDS制备的影响;根据Chr在不同介质中的饱和溶解度测定结果,筛选出对药物溶解度较大、毒性较低的油、表面活性剂和助表面活性剂来制备SMEDDS,并进行相分离实验研究,筛选出稳定的配伍进行处方研究;采用伪三元相图法进行处方筛选,并利用星点设计-效应面法优化处方;按最大载药量,以形成微乳的状态、自微乳化时间和粒径为指标,考察其对形成SMEDDS的影响,并根据实验结果进行处方微调,确定最终载药量。3.通过观察处方量空白SMEDDS和Chr-SMEDDS的颜色、粘稠度和流动性,对其外观进行评价。将处方量的空白SMEDDS和Chr-SMEDDS加入超纯水完全乳化后,用精密p H计测定p H值,通过马尔文激光粒度仪测定粒径和Zeta电位,在透射电镜下观察形态,并用染色法鉴别微乳类型;利用低温、高温、冷热循环和留样实验,以Chr的含量变化为指标,考察Chr-SMEDDS的稳定性;利用离心法测定Chr-SMEDDS的包封率;采用总体液平衡反向透析法进行体外释放度研究,并利用模拟方程对其体外释放行为进行分析。4.以SD大鼠为实验对象,用LC-MS/MS法作为检测手段,以Chr-Suspension为参比制剂,对Chr-Suspension、Chr-SMEDDS经口服,以及稀释乳化后的Chr-SMEDDS经静脉注射后,在大鼠体内不同时间点的血药浓度进行测定,平均血药浓度-时间数据用DAS 2.0软件以非房室模型进行统计矩拟合分析。5.建立Caco-2细胞单层体外吸收模型,通过显微观察、TEER的测定及碱性磷酸酶的活性检测对模型进行评价;利用CCK-8法测定不同浓度Chr制剂的Caco-2细胞存活率;考察不同时间、不同药物浓度和P-gp抑制剂对细胞摄取和细胞转运的影响;采用Western blot和免疫荧光法检测不同含Chr制剂和空白SMEDDS对ZO-1和Occludin蛋白的表达,初步探讨SMEDDS影响Chr口服生物利用度的作用机制。6.利用氧嗪酸钾（Oxonic aid potassium salt,OA）诱导建立小鼠高尿酸血症（Hypemricemia,HUA）模型,通过测定小鼠血清中尿酸（Uric acid,UA）及黄嘌呤氧化酶（Xanthine oxidase,XOD）的含量变化,探讨Chr-SMEDDS是否对高尿酸血症小鼠有降尿酸作用及可能的作用机制。结果:1.建立了Chr的HPLC体外含量测定方法,在方法学考察中,线性、精密度、重复性、溶液的稳定性和加样回收实验均符合要求;Chr在水中的平衡溶解度为38.43μg·L-1,且在p H 1.2～11的范围内,随p H的增大而增加。在所选溶解介质中,Chr在二乙二醇单乙基醚（transcutol HP）中的平衡溶解度最大,达到6.63 g·L-1;对Chr在不同p H溶液中的油水分配系数（lg P）测定结果显示:p H 1.2～9时,白杨素在不同p H溶液中的lg P为4.34～4.41,无明显变化,当p H达到10时,白杨素的lg P突然变小,当p H达到11时,白杨素的lg P进一步减小;紫外分光光度法测得白杨素具有两个解离常数,即p Ka1、p Ka2分别为6.52、7.92,为弱酸性药物。2.通过单因素实验法,以形成自微乳化时间为评价指标,分别考察了搅拌速度、温度、稀释介质和稀释倍数对SMEDDS制备的影响,最终确定选择50 r/min作为搅拌速度、37℃作为实验环境温度、超纯水作为稀释介质、稀释倍数为200倍;根据相分离实验结果,结合前期预实验结果,选取MCT、Ethyl Oleate、Oleic acid以及MCT和Oleic acid的混合物为油相,Kolliphor ELP和cremophor RH40为表面活性剂,Transcutol HP为助表面活性剂进行后续处方研究;利用伪三元相图法筛选出MCT和Oleic acid的混合物（混合比为1:1）作为油相,cremophor RH40作为表面活性剂,选择Km为1:1为表面活性剂和助表面活性剂的混合比。利用星点设计-效应面法优化得到制备SMEDDS的最佳处方为MCT和Oleic acid的混合油相（混合比分别1:1）为24%,cremophor RH40为32%,Transcutol HP为44%。对最优处方进行验证,结果表明,所用的星点设计-效应面优化具有良好的预测效果;根据最优处方确定SMEDDS对Chr的理论载药量为12.45 mg/g,考虑到整个载药体系的稳定性,实际载药量为5 mg/g。3.常温条件下,空白SMEDDS为白色透明粘稠状液体,Chr-SMEDDS呈现为淡黄色,4℃条件下,空白SMEDDS和Chr-SMEDDS流动性下降,无其他明显变化。将Chr-SMEDDS加入超纯水完全乳化后,其微乳液呈现轻微的淡黄色,在黑色背景条件下,所形成的微乳液呈现淡蓝色乳光;经100倍纯化水稀释后的Chr-SMEDDS p H值为5.6,通过马尔文激光粒度仪测定其粒径和Zeta电位,测得经稀释乳化后的空白SMEDDS微乳液和Chr-SMEDDS微乳液粒径分别为22.62 nm和27.34 nm,Chr-SMEDDS分别加入50、100、200倍超纯水完全乳化后的Zeta电位分别为-16.5 m V、-22.2 m V和-27.3 m V;经稀释乳化后的Chr-SMEDDS微乳液在透射电镜下观察形态呈圆球型,大小及分布均匀,粒径在20～40 nm之间;染色法鉴别Chr-SMEDDS经稀释乳化后所形成的微乳液为O/W型;稳定性及长期留样结果显示,在常温条件下,Chr-SMEDDS可在6个月内保持原来的颜色和澄清度,并且粒径和载药量无明显变化,说明Chr-SMEDDS稳定性良好;离心法测定Chr-SMEDDS的平均包封率为91.73%;释放度考察中Chr-SMEDDS在6 h内释放达到了85%以上,而Chr-Suspension在6 h的释放量接近55%,对释放曲线进行拟合后发现,Chr-SMEDDS的体外释放符合一级动力学方程,而Chr-suspension的体外释放符合Higuchi方程。4.体内药动学研究结果显示,静脉注射Chr-ME的半衰期(t1/2z)为（9.9±3.6）h,血药浓度与时间曲线下面积(AUC0-t)为（651.0±25.4）μg?h/L。大鼠灌胃以后,Chr-Suspension和Chr-SMEDDS的血药浓度与时间曲线下面积(AUC0-t)分别为（84.5±6.0）μg?h/L和（230.4±9.8）μg?h/L,Chr-SMEDDS相对于Chr-Suspension的体内生物利用度提高了2.73倍。Chr-Suspension和Chr-SMEDDS相对于Chr-ME的绝对生物利用度分别为1.48%和4.05%。5.建立了Caco-2细胞单层模型,显微观察细胞之间紧密连接,边界清晰,21天时的TEER值可达到696.3Ω·cm~2,AP侧与BL侧的碱性磷酸酶比值为6.25;利用CCK-8法对不同浓度Chr供试液、Chr-SMEDDS供试液和空白SMEDDS供试液的Caco-2细胞存活率测定结果表明,当Chr含量小于2.8 mg/L时,Caco-2细胞的存活率超过90%;不同作用时间和药物浓度下SMEDDS能显著增加Caco-2细胞对Chr的摄取和转运,P-gp抑制剂对Chr和Chr-SMEDDS的细胞摄取和转运无显著影响;Western blot和免疫荧光法检测结果表明,Chr-SMEDDS和SMEDDS相较与Chr,可显著减少ZO-1和Occludin蛋白的表达,表明SMEDDS可打开细胞紧密连接,使药物经细胞旁路跨膜转运,从而增加Chr的肠吸收。6.建立了氧嗪酸钾（Oxonic aid potassium salt,OA）诱导的小鼠高尿酸血症模型（Hypemricemia,HUA）,在剂量分别为20和40 mg/kg的情况下,Chr-Suspension对小鼠血清UA和XOD的含量无明显影响,而Chr-SMEDDS在40 mg/kg的剂量下可显著降低急性HUA模型小鼠的血清UA和XOD含量。结论:本研究成功制备了包封率高、性质稳定、粒径小于100 nm的白杨素自微乳化制剂（Chr-SMEDDS）;所制备的自微乳化载药系统（SMEDDS）能显著提高白杨素的溶解度和溶出,增加其体内吸收,提高其体内生物利用度;所制备的自微乳化载药系统（SMEDDS）促进白杨素体内吸收的机制可能是增加了其体内的溶出,增强了细胞对药物的摄取,并且通过打开细胞紧密连接,增强了对药物的转运;当达到一定的给药剂量时,Chr-SMEDDS可显著降低HUA模型小鼠的UA值,可能与SMEDDS增加了Chr的体内吸收,从而抑制了XOD活性有关。