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目的:
1.检测miR-216a在胃癌细胞SGC7901中的表达水平,建立microRNA的检测方法。
2.构建has-mir-216a真核表达载体,实现其在胃癌细胞SGC7901中有效表达,为进一步研究mir-216a的功能打下基础。
3.观察mir-216导入对SGC7901细胞生物学行为的影响并探讨其相关机制。
方法:
1.RT-PCR及Real-time PCR检测mir-216a在胃癌细胞SGC7901中的表达水平。
2.依据miRBase数据库中pre-mir-216a序列,设计引物；PCR扩增pre-mir-216a基因并将其克隆至PGH载体,产生PGH-pre-mir-216a重组质粒,酶切及测序验证；将pre-mir-216a基因克隆至pGenesil-1载体,产生pgenesil-1-has-mir-216a重组质粒,HindⅢ酶切,测序验证；脂质体法将pGenesil-1-has-mir-216a载体及随机片段HK的真核表达载体pGenesil-1／HK转染入SGC7901细胞。转染后24小时荧光显微镜下观察转染效率,转染后48小时RT-PCR及Real-time PCR法检测成熟mir-216a在SGC7901细胞中的表达。
3.采用MTT法和细胞周期测定分析mir-216a对SGC7901细胞增殖的影响；采用MTT法检测转染前后阿霉素(ADR)对SGC7901细胞IC50值的变化:采用RT-PCR、Real-time PCR及Western blot法检测转染前后YB-1mRNA及蛋白的表达变化；采用Real-time PCR及FCM检测转染前后MDR1mRNA及细胞膜P-gp表达的变化。
结果:
1.miR-216a在SGC7901中表达水平较低,建立起microRNA的检测方法。
2.将pre-mir-216a基因克隆至PGH载体,重组质粒酶切及测序验证显示,pre-mir-216a基因序列与the miRNA Registry的序列一致；将pre-mir-216a基因克隆至pGenesil-1载体,酶切及测序鉴定显示与理论完全一致,成功构建has-mir-216a真核表达载体；脂质体法将pgenesil-1-has-mir-216a载体转染入SGC7901细胞,获三组细胞,依次为SGC／mir-216a、SGC／HK及SGC7901组。荧光显微镜下观察转染效率约60％；RT-PCR结果显示阳性转染组成熟mir-216a表达量明显高于随机片段组及空白对照组,三组细胞以U6标化后的mir-216a灰度值分别为0.761,0.238,0.156；real-time PCR法结果显示阳性转染组mir-216a表达水平较随机片段组提高约32倍。
3.生长曲线提示阳性转染组细胞生长较对照组快,细胞周期动力学分析示阳性转染组G1期细胞显著减少,G2期与S期细胞显著增多,提示mir-216a的导入可能促进胃癌细胞的增殖；MTT法结果显示阳性转染组细胞的阿霉素IC50明显高于随机片段组和空白对照组,提示mir-216a可能参与了胃癌细胞对化疗药物ADM敏感性的调节；Real-time PCR显示阳性转染组MDR1mRNA较对照组提高2.75±0.10倍,流式细胞术检测结果显示,阳性转染组p-gp表达上调,荧光强度较对照组明显增加,说明mir-216a的导入可能调节MDR1的转录及翻译；RT-PCR显示阳性转染组YB-1 mRNA灰度值明显增加,Real-timePCR显示阳性转染组YB-1 mRNA较对照组上调3.27±0.10倍,Western blot结果显示阳性转染组YB-1蛋白条带丰度明显增加,说明mir-216a的导入可能促进YB-1的转录及翻译。
结论:1.mir-216a在SGC7901细胞中表达较低,成功建立microRNA的检测方法。2.成功构建has-mir-216a真核表达载体,并实现其在胃癌细胞SGC7901中有效表达。3.mir-216a导入SGC7901细胞能通过促进细胞周期由G1期向S期及G2期转换而促进细胞增殖,并能降低细胞对化疗药物ADM的敏感性；转染mir-216a导入SGC7901细胞能上调SGC7901细胞内MDR1、p-gp及YB-1 mRNA、蛋白的表达。综上所述,mir-216a可能通过转录及翻译水平上调YB-1的表达,进而促进MDR1 mRNA及p-gp的表达,从而降低胃癌细胞对化疗药物ADM的敏感性。靶向mir-216a有望成为逆转胃癌多药耐药的一条新的策略。