遗传转化技术已在生物基因功能分析、生理生化过程研究以及生物反应器开发等方面大量应用,但同时还存在许多问题,包括外源基因向基因组的整合效率较低,转基因有时不能按预定的方式表达,转入基因后有可能引起生物本身的功能基因发生突变等。要解决这些问题,提高遗传转化的效率,并提高整合的定向性(Site-specific integration)是关键。家蚕Bombyx mori L.是重要的经济昆虫,同时也是昆虫基因功能和生命过程研究的模式昆虫。近十多年来,人们对其开展了大量的遗传转化研究,获得了很多的家蚕转基因品系,但对其定向遗传转化的报道还很少。为此,本实验在家蚕细胞中进行了定向遗传转化的初步研究,以期为提高家蚕遗传转化效率、提高遗传转化的定向性提供一些借鉴。主要结果如下：1.采用双荧光素酶报告基因检测(Dual-Luciferase Reporter Assay)技术,比较了热激蛋白启动子(hsp70和hsp82)、家蚕肌动蛋白启动子(A3)、多聚泛素(polyubiquitin)启动子(PUB)、a微管蛋白启动子(α-tub)、丝素轻链启动子(Fib-L)、人工合成启动子3×P3及苜蓿丫纹夜蛾多角体病毒(AcNPV)增强子-启动子组合(hr5-IE1)8种启动子在家蚕细胞BmN内的活性。结果显示hr5-IE1活性最强,A3次之,其余启动子活性均较弱。构建含有hr5-IE1启动子和piggyBac的转座酶编码区的质粒作为辅助质粒,与EGFP载体质粒一起转染家蚕细胞后,实现了EGFP基因整合到细胞基因组中。2.采用质粒间转座分析(Interplasmid transposition assay)方法,研究了酵母转录激活蛋白Ga14的DNA结合区(DNA-binding domain, DBD)序列和UAS组成的系统(简称Ga14-UAS系统)在提高家蚕遗传转化定向性中的作用。将三个质粒,即表达Ga14-piggyBac融合转座酶的辅助质粒,含有Kan抗性基因和E. coli ori因子的供体质粒,及含有UAS定向序列的受体质粒,共转染家蚕卵巢细胞系(Bm-12)和果蝇细胞系(S2),结果发现,在Ga14-piggyBac融合体作用下,两种细胞中的转座效率分别比对照提高了3.8倍和4.5倍,而且插入位置趋向于少数几个位点。3. LexA是生物体内一种重要的阻遏蛋白,其结合的DNA位点(Binding sites,BS)具明显的序列特征。我们依据LexA与其BS序列结合的原理,构建了可表达LexA-piggyBac融合转座酶的辅助质粒,以及含LexA BS序列的受体质粒pGDV1-Lex-BS。将这两个质粒和供体质粒pB[KOα]一起转染家蚕Bm-12细胞,结果发现,与对照相比转化效率提高了9.0倍,但转座并不集中在一些特定的位点。与前述Ga14-piggyBac融合转座酶相比,在Bm-12细胞系中,LexA-piggyBac介导的遗传转化效率要高一些,但对转化的定向能力较差。4.在家蚕细胞内建立了一个基因组中插入EGFP-Lex-BS片段的细胞系。用于今后LexA-piggyBac融合转座酶在提高转座效率、定向能力等方面的进一步研究。根据本研究结果,针对目前家蚕遗传转化效率较低、转基因的整合缺乏定向性的不足,可选择采用hr5-IE1作为piggyBac转座酶表达的启动子,以提高该酶的表达水平,从而提高转化效率；也可采用piggyBac和Ga14-DBD或LexA融合后所形成的转座酶来提高转化效率；另外,Ga14-piggyBac融合酶还可考虑用于定向遗传转化的研究。这些结果,对提高当前的家蚕定向遗传转化水平有一定的指导意义。