研究背景:血管钙化（vascular calcification,VC）是衰老,糖尿病,慢性肾病和动脉粥样硬化等疾病的共同病理特征。VC是一个主要涉及血管平滑肌细胞（Vascular smooth muscle cells,VSMCs）凋亡和VSMCs向成骨样细胞表型转化的病理过程。在钙化过程中,胞质Ca2+和Pi与碱性磷酸酶（ALP）结合进入基质囊泡,基质囊泡脱离质膜并与细胞外蛋白（如胶原蛋白）结合。晶体最初形成磷酸八钙,经过重组并刺激高度不溶性羟基磷灰石（hydroxyapatite,HAp）的外延生长;HAp以相同的方式重复成核和结晶扩大沉积面积。研究表明,纳米羟基磷灰石（nanosized hydroxyapatite,n HAp or nano-HAp）在血管系统病理钙化进展中起着重要作用,但其具体机制尚不清楚。最近,纳米颗粒被证实对细胞的自噬功能有影响。既往研究表明,自噬在血管钙化过程中发挥重要作用。然而,现在尚缺乏证据表明nano-HAp可诱导VSMCs的自噬改变。因此,我们推测nano-HAp可能通过影响平滑肌细胞的自噬功能导致血管钙质沉积。研究目的:阐明n HAp在血管钙化发生发展中的具体作用,为防控血管钙化的进展提供新思路。在体外和体内实验模型中验证n HAp是否可以导致平滑肌细胞成骨表型转化和血管钙化,在体外模型中研究n HAp是否通过影响血管平滑肌细胞自噬功能的改变导致胞外的钙化沉积,并进一步探讨机制。研究方法:收集人体钙化主动脉标本,通过扫描电镜、透射电镜以及免疫荧光技术明确钙化血管的特征。分别人工合成和从人体钙化斑块提取n HAp,通过扫描电镜、XRD和FT-IR进行鉴定和对比。分离并扩增小鼠血管平滑肌细胞,在体外培养环境下加入n HAp共培养,通过茜素红染色,检测钙离子含量、成骨相关基因Runx2和OPN表达量和碱性磷酸酶活性等指标,明确n HAp对平滑肌细胞的作用。分别在C57BL/6J小鼠皮下植入n HAp以及在腹主动脉涂抹n HAp,行活体micro-CT扫描并行病理切片染色等明确n HAp在体内对平滑肌细胞钙化的作用。在体外培养情况下,通过透射电镜、免疫荧光染色和western blot等方法明确n HAp诱导平滑肌细胞钙化的机制。研究结果:我们发现人体钙化标本内存在纳米级别HAp,n HAp黏附在血管细胞表面,并在胞内溶酶体发现有n HAp的存在,在钙化沉积附近血管平滑肌肌细胞的钙化标志物Runx2表达明显。以上研究结果为后续研究奠定了基础。人工合成的n HAp和人体标本提取出的n HAp在形貌大小以及化学组成上是相似的,为后续的实验研究用人工合成的n HAp代替人体来源的n HAp提供了支持。体外实验中n HAp处理小鼠平滑肌细胞后,钙化标志物Runx2,OPN的表达和ALP活性较对照组明显升高,且n HAp导致平滑肌细胞外大量的钙沉积且明显高于普通钙化培养基组。以上研究表明n HAp可以导致SMCs成骨样转化并可加速钙化沉积。在体内实验中,n HAp可以导致皮下移植组织和腹主动脉钙沉积,且诱导平滑肌细胞Runx2表达增加。为了明确n HAp诱导钙化的机制,透射电镜发现人体来源和人工合成的n HAp处理小鼠平滑肌细胞后,n HAp均可被细胞内吞,并进入溶酶体内,且导致自噬小体较空白对照组明显增多。经n HAp处理后,细胞内LC3-II和p62升高。LC3双荧光腺病毒证实n HAp引起平滑肌细胞自噬流阻断。LC3与溶酶体的标志物（Rab7,LAMP1）免疫荧光共染示n HAp不影响自噬小体与溶酶体融合。因此,下一步我们对溶酶体的功能进行探究。经n HAp处理后溶酶体酸性下降,组织蛋白酶D（CTSD）成熟相减少,未成熟相增多,EGFR降解实验表明n HAp影响EGFR在溶酶体的降解,均提示溶酶体功能障碍,影响自噬降解。溶酶体质子泵V-ATPase与LAMP1共定位率下降,提示质子泵受到损伤可能是溶酶体酸化能力下降的原因。提取VSMCs上清中外泌体发现,n HAp促进VSMCs外泌体释放,外泌体中钙含量明显增加。且n HAp处理组外泌体中LC3和LAMP1明显增加。外泌体释放抑制剂GW4869可下调n HAp引起的外泌体释放,抑制钙质沉积。最后我们对平滑肌细胞成骨样转化的机制通路进行探讨,n HAp处理VSMCs可以激活c-JUN氨基末端激酶/c-JUN（JNK/c-JUN）通路磷酸化,JNK磷酸化的抑制剂sp600125可下调成骨标志物Runx2和OPN的表达以及ALP活性,n HAp引起的钙质沉积也相应下降。研究结论:纳米HAp一方面通过激活JNK/c-JUN信号通路促进平滑肌细胞成骨转化,一方面通过损伤平滑肌细胞溶酶体质子泵,致溶酶体功能下降,从而影响自噬降解,导致胞内自噬小体和自噬溶酶体聚集,促进外泌体释放,加速血管钙化沉积。