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目的：HPV18 E6癌蛋白与宫颈癌发生、发展密切相关。应用酵母双杂交系统，构建HPV18E6癌蛋白诱饵质粒，在Hela细胞cDNA文库中筛选与HPV18 E6癌基因直接相互结合蛋白，并对TMEM 87B进行生物信息学分析，探讨HPV18 E6和vimentin直接相互作用在顺铂诱导宫颈癌细胞衰老中的功能效应。方法：1．应用RT PCR扩增HPV18E6基因cDNA开放阅读框基因片段后与pGBKT7载体定向重组，通过酶切测序鉴定重组质粒；醋酸锂法将pGBKT7-HPV18 E6重组质粒转化AH109酵母菌株，缺陷性培养基上观察AH109生长情况，检测诱饵载体有无毒性作用和单倍体及二倍体自激活效应。2．将成功构建的pGBKT7-HPV18E6重组质粒醋酸锂法转化感受态酵母菌AH109，随后转化Hela MATCHMAKER cDNA文库质粒，筛选阳性克隆。提取酵母质粒纯化后电转感受态大肠杆菌DH5α，提取阳性质粒，排除假阳性和重复插入片段后酶切电泳、测序后行基因序列分析宫颈癌HPV18 E6直接相互作用蛋白。3．应用因特网资源，运用BLAST、ProtParam tool、The ELM Server及InterProScan等数据库或在线软件对TMEM 87B基因及其编码蛋白进行生物信息学分析，预测其基因结构、染色体定位、编码蛋白质理化性质、亚细胞定位、蛋白质功能域等信息，并对多物种中的相似性蛋白进行了系统进化分析。4．酵母体内和体外Co-IP法验证HPV18 E6和vimentin直接相互作用；免疫组化法检测HPV18 E6和vimentin蛋白及CBX3蛋白在人宫颈癌切片中的表达情况。应用不同浓度梯度顺铂作用Hela细胞，选择最佳诱导衰老而无明显凋亡发生的实验浓度。检测Hela细胞衰老过程中HPV18 E6和vimentin以及P53、P21、CDC2等衰老相关调控基因表达变化；应用SA-βG al(衰老相关β-半乳糖苷酶)染色法检测通过脂质体法单独转染或共转染siRNA-HPV18 E6和siRNA-vimentin时顺铂诱导肿瘤细胞衰老敏感性变化情况；PI单染流式细胞仪检测细胞周期变化；Western blot检测P53、P21、CDC2等衰老相关调控基因表达变化情况；建立顺铂诱导宫颈癌肿瘤细胞衰老动物模型；分析衰老动物模型中HPV18 E6和vimentin表达变化。结果：1．成功构建重组质粒pGBKT7-HPV18 E6，转化重组质粒pGBKT7-HPV18 E6和pGBKT7空载体的酵母菌在YPDA液体培养基中培养16h后，菌液的A600nm值分别为0．98和0．99；两种酵母菌均在SD／-Trp／X-α-gal平板上长出白色菌落，在SD／-His／-Trp／X-α-gal，SD／-Ade／-Trp／X-α-gal平板上不能生长，pGBKT7-HPV18E6转化酵母菌AH109与pGADT7-T转化酵母菌Y187交配后二倍体在SD／-Trp／-Leu培养盘中能长出白色克隆，而在SD／-His／-Trp／-Leu／X-α-gal及SD／-Ade／-His／-Trp／-Leu／X-α-gal盘中均无克隆生长，说明重组质粒pGBKT7-HPV18E6对酵母菌AH109无毒性且不具自主激活报告基因效应。2．该诱饵载体应用于在Hela细胞cDNA文库中筛选与HPV18E6相互作用的蛋白质，随机挑取50个克隆进行电转后，双酶切后电泳，测序鉴定7种与HPV18E6直接相互作用蛋白：跨膜蛋白87B、膦甲酸免疫相关蛋白5、波形蛋白Vimentin、KM-HN-1蛋白、无功能糖基转移酶样蛋白7、痘苗相关激酶蛋白2以及一种未知蛋白。3．对获得的7种阳性蛋白进行初步生物信息学分析确定其生物功能，对TMEM 87B蛋白进行进一步分析，发现TMEM87B是一种6次跨膜的分泌性蛋白，有众多磷酸化位点和功能基序，在多物种间有高度保守序列，与肿瘤生成信号转导和转录调控相关；4．免疫组化结果显示CBX3在CIN和宫颈癌早期表达达高峰，而HPV18 E6和vimentin在宫颈癌早期呈高表达。在一定小剂量顺铂(3．300μM)诱导下，Hela细胞呈现衰老表型，细胞变大变扁平，胞浆空泡增多，SA-βGal染色呈阳性着色，细胞周期阻滞在G2／M期，细胞调亡不明显，P53、P21、P-CDC2基因在顺铂诱导衰老过程中表达增强。分别转染50nM siRNA-vimentin和50nM siRNA-HPV 18 E6后，增敏顺铂(1．650μM)诱导Hela细胞衰老(P＜0．05)；共转染50nM siRNA-vimentin和50nM siRNA-HPV18 E6后，Hela细胞衰老率增加，且增敏顺铂(0．825μM)诱导Hela细胞衰老(P＜0．05)。衰老细胞变大、变园、扁平，衰老相关β-半乳糖苷酶染色阳性；细胞周期G2／M期阻滞；vimentin、P53、CDC-2表达上调，HPV 18 E6表达下调。结论：七种与HPV18E6相互作用的蛋白质可能是潜在的宫颈癌检测指标。TMEM87B是一种6次跨膜的分泌性蛋白，可能与肿瘤生成信号转导和转录调控相关；HPV18 E6和vimentin直接相互作用可能抵抗了顺铂诱导宫颈癌细胞衰老。