趋化因子是一组通常由70-90个氨基酸组成的小分子量(8-14KD)蛋白质，通过与细胞膜相应的G蛋白偶联受体结合而发挥多种生物学作用。趋化因子家族目前包含50种趋化因子及18种趋化因子受体。其中CXCL16是最新被鉴定的趋化因子，在体内以细胞结合型和分泌型两种方式存在，发挥不同的生物学作用，CXCR6被确认为它的唯一受体。既往我们研究发现，人早孕滋养细胞高度转录CXCR6，因此推测其上游信号CXCL16可能参与滋养细胞的生物学调控。因此我们围绕母胎界面局部表达的CXCR6和CXCL16进行了本课题的研究设计，以探讨这一独特的趋化因子对在母胎界面的表达特征及其生物学意义。1．人早孕母胎界面主要功能细胞的分离、培养和鉴定母胎界面的胎儿面主要由滋养细胞组成，我们按照本实验室建立的方法，进行了绒毛滋养细胞、绒毛外滋养细胞的分离、培养和鉴定，收获的细胞纯度达90-95％。母胎界面母体面的蜕膜主要由蜕膜基质细胞和蜕膜免疫细胞构成。以往国内外关于蜕膜免疫细胞的研究多限于单色荧光标记白细胞抗原，难以真实反映各亚群细胞的实际数量。我们在研究中，设计了酶消化、Percoll密度梯度离心、短期培养结合的方法同时分离纯化蜕膜基质细胞和蜕膜免疫细胞，应用多色荧光抗体同时标记免疫细胞表面抗原，以鉴定蜕膜免疫细胞亚群。该方法分离得到的蜕膜基质细胞经免疫细胞化学鉴定细胞纯度可达99％；我们采用三色、双色、单色荧光直接标记法，分别分析早孕妇女蜕膜、外周血NK细胞(CD3~-CD56~+CD16~-和CD3~-CD56~+CD16~+)、NKT细胞(CD3~+CD56~+)、γδT细胞(CD3~+γδTCR~+)、T细胞(CD3~+)和单核细胞(CD14~+)的阳性率。结果发现：CD56~+CD16~-NK细胞约占蜕膜免疫细胞总数的(67.02±18.33)％，T细胞占(11.05±7.22)％，单核细胞占(5.28±0.291％，NKT细胞占(2.35±1.62)％。早孕妇女外周血T淋巴细胞较正常生育期妇女明显下降(p＜0.05)；而早孕妇女外周血NK细胞、NKT细胞、单核细胞数量与对照组相比无显著差异。2．趋化因子CXCL16及其受体CXCR6在人早孕母胎界面的表达本研究首先采用Real-time RT-PCR和免疫化学的方法从转录和翻译水平分析滋养细胞和蜕膜基质细胞CXCL16／CXCR6的表达。发现细胞滋养细胞、合体滋养细胞和绒毛外滋养细胞均高表达CXCL16／CXCR6。蜕膜基质细胞虽高水平转录CXCR6，低水平转录其配体CXCL16；但CXCL16和CXCR6在蛋白水平的表达均很低。我们随后采用多色荧光标记的流式细胞术分析了蜕膜免疫细胞CXCR6的表达水平。结果显示γδT细胞CXCR6的平均表达率最高，达(87.29±6.95)％；单核细胞和NKT细胞CXCR6呈中度表达，其阳性率分别为(47.71±6.04)％、(44.14±4.41％；T细胞CXCR6的平均表达率为(30.39±5.23)％；而蜕膜CD56~+CD16~-NK细胞和CD56~+CD16~+NK细胞几乎不表达CXCR6，其阳性率分别为(4.79±1.3)％和(4.84±0.77)％，且两者之间无显著性差异(P＞0.05)。3．CXCL16对人早孕滋养细胞的自分泌调控作用原代培养人滋养细胞100小时，收集培养上清检测CXCL16的分泌水平。ELISA分析发现：滋养细胞能够持续分泌趋化因子CXCL16，当种植密度为1×10~6cells／ml时，48h累积分泌浓度为1.65ng／ml，100h累积分泌浓度为2.69ng／ml。应用IFN-γ处理后，可启动滋养细胞内CXCL16的合成，上调CXCL16的表达和分泌水平。而经ADAM10处理后，只能加速滋养细胞表面CXCL16的释放，不能促进CXCL16的合成。外源性CXCL16处理滋养细胞，~3H-TdR掺入法和MTT比色法分析其对滋养细胞增殖能力的影响。结果发现CXCL16能够有效诱导滋养细胞的增殖，而且呈明显的量效依赖关系，其促增殖效应可被相应中和性抗体阻断。在CXCL16诱导滋养细胞增殖后，我们采用Western blot方法分析了P13K信号转导通路中Akt的磷酸化水平，发现CXCL16能够迅速磷酸化滋养细胞中的Akt，在10-30min达最高峰，效应持续时间不少于2小时。外源性CXCL16处理滋养细胞，Matrigel侵袭试验分析其对滋养细胞侵袭能力的影响。结果显示，当rhCXCL16浓度低达10ng／ml时，即可明显促进滋养细胞的侵袭；当rhCXCL16浓度为200ng／ml时，侵袭指数最高，这种侵袭效应可被CXCL16的中和性抗体阻断。因此，CXCL16不仅促进滋养细胞的增殖，而且促进其侵袭，在诱导增殖中可能启动了细胞内的P13K途径。由于滋养细胞在各个分化阶段均表达CXCL16和CXCR6，据此可推测趋化因子CXCL16可能参与滋养细胞的分化和胎盘形成。4．人早孕期滋养细胞分泌CXCL16参与蜕膜免疫细胞的募集和粘附我们首先分离了人外周血单个核细胞，流式细胞术分析各群细胞CXCR6的表达水平。随后采用Transwell法分析CXCL16和滋养细胞条件培养液(TCM)对PBMC趋化能力的影响。结果显示，CXCL16可选择性地趋化外周T细胞、γδT细胞和单核细胞，对CD56~+CD16~+NK细胞也具微弱的趋化效应；来源于滋养细胞的TCM对于NK细胞、T细胞和单核细胞均显示很强的趋化活性；而抗CXCL16抗体可以完全或部分抑制CXCL16或TCM的趋化效应。有趣的是，被TCM或CXCL16趋化后的PBMC的构成比例与蜕膜免疫细胞比例非常相似。之后，我们分离了蜕膜免疫细胞重复了上述实验，得到了类似的结果。即CXCL16选择性地趋化蜕膜T细胞、γδT细胞和单核细胞，TCM对于蜕膜的三种主要免疫细胞即NK细胞、T细胞、单核细胞均表现很强的趋化能力，经CXCL16和TCM趋化后的蜕膜免疫细胞构成比与趋化前相似。因此早孕期滋养细胞合成和分泌的趋化因子CXCL16不仅引导外周T细胞、γδT细胞和单核细胞进入蜕膜，还使它们停留在滋养细胞附近的蜕膜组织中。综上所述，本研究首先建立了母胎界面滋养细胞、蜕膜基质细胞和蜕膜免疫细胞的分离方法；系统研究了CXCL16／CXCR6在上述细胞的表达水平；阐明了早孕滋养细胞通过自分泌和旁分泌CXCL16促进自身增殖和侵袭的生物学行为，从而促进胎盘的早期发育和结构的稳定性；并提出人早孕滋养细胞通过合成和分泌CXCL16，招募外周T细胞、γδT细胞和单核细胞入侵蜕膜，并引导它们聚集于滋养细胞附近的蜕膜组织中，从而维持母-胎界面特殊的免疫状态。