端粒是染色体末端的六核苷酸“TTAGGG”组成的重复序列，有防止染色体降解、重排、缺失、断端彼此发生融合等作用。随着细胞的分裂，由于线性染色体的不完全复制，端粒逐渐缩短，当端粒缩短到一定程度时，即引起细胞的死亡。端粒酶是一种特殊的逆转录酶，自身携带有RNA模板，激活的端粒酶可以以此合成端粒序列，使细胞无限增殖，逃避死亡。 研究已发现端粒酶在除造血组织和生殖细胞外的正常组织中不表达或低表达，而在大于85％的肿瘤组织中高表达，这表明端粒酶的激活可能是肿瘤发生过程中的关键因素。对端粒酶的研究揭示端粒酶至少由三部分组成：端粒酶RNA(telomerase RNA moiety，hTR)，端粒酶逆转录酶(telomerase reverse transcriptase，hTERT)，端粒酶相关蛋白(telomerase-associated protein，hTP1)。其中hTERT是端粒酶的催化亚单位，是1997年才被克隆分离到的一种单拷贝基因，其基因含有逆转录酶催化区域高度保守的特异序列，已证实与端粒酶活性表达一致，成为肿瘤研究中的新的靶点。 针对hTERT与肿瘤的密切相关性，本研究以hTERT为靶点，从不同的角度深入探讨其在肿瘤的基因诊断和基因治疗中的作用和价值，以期为临床肿瘤患者的诊断和治疗提供理论依据和实验证据，更好的服务于临床。 本研究首先以端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse trascriptase，hTERT)基因的cDNA全长序列构建反义hTERT的真核表达载体，以此来封闭肿瘤细胞PLA-801D中hTERT基因的表达。探讨hTERT基因被封闭后肿瘤细胞表型及生长特性的改变。方法：构建了包含hTERT全长cDNA序列的反义hTERT基因真核表达载体pcDNA3.1(-)-hTERT，稳定 军医进修学院 摘要 硕士学位论文 转染人肺巨细胞癌细胞系PLA－smD，观察及比较反义hTERT基因转染前 后PLA－80iD细胞的生长特性，hTERT mRNA表达水平及端粒酶活性的 改变；以及细胞周期分布的变化和周期相关蛋白P53 mRNA表达水平的变 化和 P53蛋白表达的差异。结果：全长的反义 hTERT CDNA可有效地抑 制野生型hTERT mRNA的表达，使端粒酶活性显著受抑，PLA－80iD细 胞生长能力显著降低；同时细胞周期分布发生变化，弓】起 GO／GI期阻滞， P53 mRNA表达水平显著降低，P53蛋白的阳性率显著下降。 其次，为了寻找一种可以有效抑制 hTERT的特异性药物，来用于肿 瘤的治疗，本研究选用了已证实对白血病治疗取得了显著疗效并正在进行 用于实体瘤治疗研究中的药物 As。O3；以人宫颈癌细胞 Hela和人肺巨细胞 癌细胞PLA－80iD为研究对象，观察三氧化H砷对Hela细胞和 PLA－80iD 细胞端粒酶活性及肛＊盯rnRN A表达的影响。方法：以ZVmd几的三氧 ｛tH砷作用于Hela细胞和PLA－80iD细胞，在不同时间点用MTT法检测 两种细胞增殖活力的变化，用流式细胞仪检测细胞周期的变化，用RTPCR 法检测 hTERT mRNA表达的变化，用 TRAPELISA法检测端粒酶活性的 变化。结果：随着三氧化二砷作用时间的延长，两种肿瘤细胞的增殖活力 均逐渐降低，GO／GI期细胞所占比例升高，S期细胞所占比例减少，hTERT mRNA表达水平逐渐降低，端粒酶活性逐渐下降。 hTERT与肿瘤的密切相关性不仅局限于肿瘤的治疗方面，在肿瘤的诊 断中，hTERT也可成为一个有价值的检测指标。为探讨其临床应用价值， 本研究的第三部分以 hTERT为靶点，应用巢式RTPCR方法检测膀耽癌 患者尿液脱落细胞中的 hTERT mRNA表达，探讨其在膀耽癌的无创诊断 中的应用。方法：以膀眺癌患者为研究对象，取其尿液中的脱落细胞，以 泌尿系非上皮肿瘤患者的尿液脱落细胞为对照，巢式RTPCR方法检测 hTERT mRNA表达；同时与肿瘤的数量、大小、部位、病理分型分级、 临床分期的关系进行统计学分析；与膀肽镜检查和脱落细胞学检查结果进 行比较，判断其应用于膀肤癌诊断的可行性。结果：膀肤癌患者尿液脱落 细月包hTE盯 m删A的检出率为 giO，对照组的检出率为 5O，敏感性和 3 军医进修学院 摘要 硕土学位论文 特异性分别为 giO，95O。hTE肚 m叫A的表达量与肿瘤的病理分级和 临床分期均无相关性。 结论： l，hTERT基因在 PLA－80 D细胞中高表