水稻温敏不育系是两系杂交水稻育种的重要种质资源也是研究雄配子发育和植物感应温度的重要材料。水稻雄配子体发育包含花药细胞分化、绒毡层细胞程序性死亡、花粉壁形态建成和淀粉充实等连续的发育过程,是生殖发育基础理论研究和水稻杂交育种的关键过程。任何参与这些过程的基因突变,均能引起花药发育异常,最终导致雄性不育。花粉壁构建是一个极其复杂而有序的过程,包含胼胝质壁、初生外壁、外壁和内壁的各个细胞壁层发育及相互影响,涉及孢子体和配子体的共同作用,其过程严格受多个基因的精细调控。虽然目前对花粉壁发育的基因有一定的了解,但是关于花粉壁发育的研究仍有很大的疑惑需要解开。本实验室之前发现一个新的温敏不育突变体,将其命名为tms10,通过遗传分析发现TMS10可能编码一种羟基肉桂酰基转移酶(Omega-hydroxypalmitate O-feruloyl transferase/omega-hydroxyacid O-hydroxycinnamoyl transferase,HHT)。本研究通过功能互补等转基因方法确定了TMS10编码HHT,通过分子生物学、细胞生物学等方法试图解开TMS10调控的相关分子机理。本文主要研究内容和结果如下:1.在相同的光照13h的条件下,tms10在高温条件下,即平均温度为28℃以上,其花粉粒为完全败育,呈皱缩状,而在低温条件下,即平均温度为22℃,其花粉粒基本为可育,呈球形饱满状,这说明tms10的花粉育性受温度调控。2.通过制作半薄切片和超薄切片对高低温处理的tms10突变体的花药发育过程进行观察。其结果显示,与对照培矮64相比,在S7-S8时期高温处理tms10突变体的胼胝质沉积减少,在S9时期,高温处理tms10的绒毡层偏薄,其花粉外壁内层开始出现不连续的现象,最后形成皱缩的无内壁、无内含物,外壁内层虽断裂却更厚的花粉粒。低温处理的tms10花粉粒的育性恢复、结构基本与对照培矮64一致。3.通过对候选基因测序,发现与安农N和中花11相比,tms10突变体的其中一个候选基因发生点突变,由G(鸟嘌呤)变成了T(胸腺嘧啶),氨基酸也由原来的精氨酸(Arg)突变为亮氨酸(Leu),并把该野生型基因命名为TMS10。生物信息学分析发现其蛋白具有BAHD酰基转移酶家族的两个保守结构域HXXXD和DFGWG,属于酰基转移酶家族中的蛋白,其功能相似于拟南芥中的HHT。4.分别构建TMS10的过表达、功能互补、干涉和Cas9载体,前两者转化tms10突变体植株而后两者转化中花11,随后对转基因植株的表型进行观察。结果发现,功能互补植株(tms10-FC)和过表达植株(tms10-OE)的育性得到恢复,干涉植株(tms10-RNAi)的育性有所下降,cas9植株(tms10-CAS9)的花粉却完全败育且低温处理后育性不能恢复,这些表明TMS10调控水稻温敏不育。5.通过制作半薄切片和超薄切片对cas9转基因植株(tms10-CAS9)和TMS10转到PA64背景下的Pt植株(低温不能恢复育性)的花药发育过程进行观察。其结果显示,tms10-CAS9的绒毡层推迟降解,中层无退化,最后形成皱缩的缺陷花粉粒。Pt植株的中层在S10时期发生肿胀,其表层还出现了角质层,最后中层退化,形成有缺陷的成熟花粉粒。在中花11、tms10-CAS9和Pt之中,Pt药室表皮外层的角质层出现最早,但在S13时期其角质层是最薄的。tms10-CAS9植株和Pt植株除了与tms10有同样的缺陷花粉外,其他的败育特征的不同,说明其花粉育性还受其他基因的调控。6.qRT-PCR结果显示,TMS10在两周水稻幼苗的根、花药、叶鞘、叶均有表达,幼叶中的表达量最低。在水稻花药的S8时期,TMS10在高温条件下的表达量约为低温的3倍。在花粉发育过程中的时空表达特征为:TMS10的表达量从S5到S8时期不断上升,在S8时期最高,之后一直下降,S12表达量为最低。7.为了探究TMS10在细胞中的表达部位,构建TMS10与GFP融合的瞬时表达载体,通过PEG沉降法转化原生质体和基因枪转化水稻幼苗叶鞘进行亚细胞定位。其结果显示,TMS10定位在细胞膜上。8.为了检测花粉壁化学成分的变化,我们用苏丹红7B和Fluorol Yellow088分别染花粉壁的脂质和软木脂,结果显示其脂质含量减少,软木脂成分提高。在紫外线下观察花粉壁的酚类物质,发现其酚类物质增加,与Fluorol Yellow088染色结果一致。综上所述,本研究证明水稻温敏不育基因TMS10参与花药相关聚酯合成,这些物质进一步参与花粉外壁的形成。这一过程的异常导致小孢子发育不正常,并最终导致花粉败育。研究结果对阐释水稻花药发育和脂质代谢过程具有重要意义,并为水稻温敏不育基因在育种上的应用提供了新的遗传资源。