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神经管畸形(neural tube defects,NTDs)是一种严重的出生缺陷,由神经管闭合不全引起,在世界范围内每1000个新生儿中就有1个患有NTDs。小鼠神经管闭合发生于8.5～10.5dpc之间。起初神经上皮分化为神经祖细胞进而形成神经板,接着神经上皮发生顶端收缩使神经板在背部中线弯曲形成神经褶。随后神经褶在背外侧铰链点弯曲,使神经褶两端接触融合形成神经管。NTDs分为露脑畸形(exencephaly)、颅脊柱裂(craniorachischisis)和脊柱裂(spinabifda)。p53N236S(以下简称p53S,纯合点突变为p53s/s)是本实验室在早衰细胞(G5 mTR-/-Wrn-/-)逃逸衰老并发生肿瘤化过程中,发现的p53 DNA结合区发生的一个错义点突变,即p53蛋白的236位点由天冬酰胺突变为丝氨酸。前期研究发现,p53s/s小鼠胚胎存在露脑及脊柱裂等NTDs表型。本文主要研究p53突变(p53N236S)在神经管闭合过程中的获得性新功能。为进一步验证这一表型,采用p53s/s♂×p53s/+♀交配方式,分别剥离9.5dpc、10.5dpc、12.5dpc、13.5dpc和16.5dpc小鼠胚胎,发现在156只p53s/s雌性胚胎中,116只表现为NTDs,约占雌性胚胎的74.3%。在同等饲养条件下,p53-/-NTDs胚胎约占雌性胚胎的38.88%(14/36),结合文献报道的23%,p53s/s雌性胚胎NTDs发生率远高于p53--,提示p53S在神经管闭合过程中具有获得性新功能。对9.5dpc～13.5dpcp53s/s NTDs胚胎包埋、切片,HE染色,发现NTDs雌性胚胎表现为神经管不闭合,并且随着天数的增加不闭合的程度逐渐加剧。同时,露脑畸形的雌性胚胎脑室出现萎缩,我们推测这可能是由于脑部神经细胞的过度增殖所引起。因此,我们利用BrdU掺入和pH3免疫组化实验,检测9.5dpc和10.5dpcp53s/s NTDs和WT中神经细胞增殖水平。9.5dpc,p53s/sNTDs中BrdU掺入阳性率为50%,pH3阳性率为9%,显著高于野生型胚胎的30%和5%。10.5dpc,p53s/sNTDs中BrdU掺入阳性率为45%,pH3阳性率为8%,同样高于野生型胚胎的30%和4%。表明p53S导致神经细胞的异常增殖。结合前期实验数据,Wrn-/-p53s/s雌性胚胎NTDs的发生率38%,提示在p53S背景下敲除Wrn基因,抑制细胞增殖,可以缓解NTDs的发生。检测10.5dpc Wrn-/-p53s/s NTDs神经细胞增殖水平,发现Wrn-/-p53s/s NTDs神经细胞的增殖率(BrdU掺入阳性率为35%,pH3阳性率为6%)低于p53s/s NTDs。进一步说明p53S通过促进神经细胞异常增殖,抑制神经管的闭合。同时,我们也检测了p53-/-NTDs神经细胞增殖,发现p53-/-NTDs雌性胚胎中神经细胞的增殖水平(BrdU掺入阳性率为46%,pH3阳性率为7%)显著高于WFT(BrdU掺入阳性率为30%,pH3阳性率为4%)。但其增殖率与p53s/s NTDs(BrdU掺入阳性率为45%,pH3阳性率为8%)相比没有显著差异,提示p53S可能通过p53的功能缺失导致神经细胞异常增殖,影响神经管的闭合。在神经管闭合过程中,神经祖细胞的增殖和分化是相对平衡的过程。p53s/sNTDs神经细胞的增殖异常升高,可能会影响神经细胞的分化。因而,我们利用Tuj1免疫组化实验,检测p53s/sNTDs胚胎神经细胞分化。Tuj1在9.5dpcWT和p53-/-NTDs胚胎中表达,而p53s/sNTDs胚胎中未检测到Tuj1。10.5dpc p53s/sNTDs胚胎Tuj1阳性率(5%)相对于WT(12%)和p53-/-NTDs(12%)显著降低,提示p53S通过p53功能获得引起神经细胞分化延迟。在实验中发现p53s/s雌鼠出生率约为25.5%,且没有异常表型。我们利用高架、悬尾等行为学实验,检测p53s/s雌鼠和雄鼠的焦虑和抑郁水平。旷场实验发现,相较于WT雌鼠,p53s/s雌鼠更为焦虑,而p53s/s雄鼠焦虑水平没有显著差异。悬尾实验显示,相对于WT雌鼠的不动时间(204.1±21.62s),p53s/s雌鼠显著升高(295.4±11.76s),表明p53s/s雌鼠比WT雌鼠更抑郁。p53S不仅引发雌性胚胎的NTDs表型,也影响雌性胚胎脊椎发育。阿利新蓝染色实验,检测13.5dpc p53s/s胚胎的骨骼情况。发现p53s/s雌性胚胎存在椎体融合现象,其发生率约占雌性胚胎的35%(7/20)。PET/CT检测p53s/s成年雌鼠的骨骼,同样发现1例椎体融合表型(1/5)。表明p53S影响小鼠的脊柱发育,且具有性别偏好性。同时我们也检测p53-/-胚胎的骨骼情况,发现p53-/-雌性胚胎也存在椎体融合现象,发生率约为33.3%(1/3)。qRT-PCR 结果显示:p53s/s NTDs和p53-/-NTDs胚胎 BMP2、BMP3、BMP4、Smad2、Runx2以及Osx的表达量显著降低。提示p53S可能通过p53的功能缺失抑制BMP通路影响骨骼的发育。综上所述,p53S纯合点突变不仅引发雌性胚胎的NTDs表型,也影响其脊椎的发育。一方面,p53S可能通过促进神经细胞的异常增殖、延迟神经分化,导致NTDs的发生;另一方面,p53S可能通过抑制BMP通路,影响脊柱的发育。行为学实验发现p53s/s雌鼠表现为更焦虑和抑郁。