一、目的胚泡着床是生殖过程中的关键环节和限速步骤,这一过程包括胚泡与子宫内膜上皮细胞的识别、定位、黏附,进而穿过基底膜植入到子宫内膜。子宫内膜容受状态受雌激素(estrogen,E2)、孕激素(progestin,P4)、细胞因子和生长因子等许多因素的共同调节,使胚泡与子宫双方发生一系列同步的变化,活化的胚胎只有在子宫内膜进入―着床窗口期‖才能着床,此时子宫腔内的液体减少,使游离的胚胎与子宫内膜充分接触,有利于胚胎黏附在子宫内膜上。水通道蛋白(Aquaporins,AQPs)在细胞膜上广泛表达,完成对各种上皮和内皮组织的液体转运以维持机体内环境稳定外,并参与血管生成、肿瘤细胞迁移与侵袭、组织损伤修复、维持细胞稳态和免疫功能等多种重要生命活动。有研究表明胚胎着床过程中子宫内膜AQPs表达存在变化,但AQPs对胚胎着床调控机制并不明确。本文检测Aquaporin 3(AQP3)在小鼠不同动情周期和自然早孕小鼠子宫内膜的表达及分布情况,并分析AQP3在人不同时期子宫内膜及不同接受态子宫内膜细胞中的表达,探讨孕、雌激素对AQP3表达的影响,以及调控AQP3表达对胚胎与不同接受状态子宫内膜黏附、侵袭和迁移影响。明确其在胚胎着床过程中的功能及作用机制,对生殖疾病治疗以及提高辅助生殖成功率具有一定意义。二、方法(一)水通道蛋白3在不同时期小鼠子宫内膜及蜕膜化组织中表达1.用阴道涂片的方法确定小鼠的动情周期;将不同动情周期小鼠的子宫解剖组织用37℃PBS清洗后,拍照观察子宫大小充水情况;用免疫组化、Western blot及Real-time PCR技术,检测小鼠不同动情周期中AQP3表达与定位情况;2.用免疫组化检测小鼠妊娠D1和D5,AQP3分布及表达情况,并用Western blot及Real-time PCR分析其表达情况;3.小鼠妊娠D8天,用免疫组化的方法分析小鼠着床位点和非着床位点的子宫内膜与蜕膜组织中AQP3的分布及表达情况;(二)AQP3随月经周期变化及在胚胎着床中的机制研究1.通过免疫组化方法检测AQP3在不同月经周期子宫内膜中的表达及分布;2.通过Western blot、Real-time PCR及免疫荧光方法检测AQP3在不同接受态子宫内膜细胞中的表达与分布情况;3.利用脂质体转染法将重组的AQP3过表达质粒转染到人子宫内膜细胞系HEC-1A细胞(低接受态子宫内膜上皮细胞),利用脂质体转染法将重组的AQP3干扰质粒(AQP3-si RNA)转染到人子宫内膜细胞系RL95-2细胞(高接受态子宫内膜上皮细胞);4.通过Transwell小室、细胞划痕检测AQP3对子宫内膜细胞的侵袭和迁移的影响;用JAR细胞模拟胚胎,通过黏附实验检测AQP3对子宫内膜细胞与胚胎细胞之间黏附情况;5.通过Western blot、Real-time PCR检测用不同浓度孕激素、雌激素和卵巢类固醇类激素对AQP3基因及蛋白表达的影响;6.通过Western blot检测,E2P4通过AQP3介导RL95-2细胞发生EMT;通过细胞划痕和Transwell实验分析卵巢类固醇激素通过AQP3介导RL95-2细胞的迁移和侵袭;7.通过免疫共沉淀和免疫荧光实验检测AQP3与Ezrin之间的相互作用;通过Western blot、Real-time PCR检测,卵巢类固醇激素和AQP3-si RNA作用RL95-2细胞后,检测AQP3和Ezrin之间调控关系;8.鬼笔环肽染色,通过荧光检测,AQP3与细胞骨架之间的调控关系;通过免疫荧光检测AQP3与Ezrin之间的调控关系。三、结果(一)水通道蛋白3在不同时期小鼠子宫内膜及蜕膜化组织中表达1.AQP3在小鼠动情周期过程中,主要表达在子宫内膜基质中,子宫腔上皮细胞和腺上皮细胞无表达。主要表达在小鼠动情前期和动情期,后期最少;在小鼠的动情前期和动情期子宫肿大充水且子宫腔隙大,后期和间期子宫细长,基本无空隙,后期尤为突出;2.AQP3主要表达在小鼠子宫内膜基质中,在子宫内膜腔上皮和腺上皮无表达,在妊娠小鼠D5的AQP3的表达量比妊娠D1天的表达量高。并且在小鼠妊娠D5,围绕子宫内膜腔的基质中表达量比子宫壁周围表达量高;3.在妊娠小鼠D8,AQP3在着床位点的子宫内膜中及蜕膜组织无表达,在非着床位点的子宫内膜和肌层有较高表达。(二)AQP3随月经周期变化及在胚胎着床中的机制研究1.AQP3主要表达在人月经周期的分泌中期和分泌晚期的腔上皮和腺上皮细胞的基底侧,分泌中期表达量出现峰值;2.AQP3表达量在RL95-2细胞中的表达量高于HEC-1A细胞;3.通过质粒转染上调HEC-1A细胞的AQP3的表达;质粒转染下调RL95-2细胞的AQP3的表达4.AQP3促进细胞的迁移和侵袭,对黏附无影响;5.孕激素能够上调AQP3的表达,低剂量的雌激素能上调AQP3的表达,高剂量的雌激素无作用甚至能抑制AQP3的表达,E2P4比同剂量的孕激素、雌激素单独作用,对AQP3表达的促进作用更为明显;6.卵巢类固醇激素通过AQP3介导子宫内膜细胞(RL95-2细胞)发生EMT,促进细胞的迁移和侵袭;7.通过免疫共沉淀和免疫荧光检测到AQP3与Ezrin之间存在相互作用;AQP3与Ezrin之间不存在表达量上的调控关系;8.卵巢类固醇激素通过AQP3促进细胞骨架中丝状伪足、板状伪足的形成和应力纤维的重构;卵巢类固醇激素通过AQP3影响Ezrin在细胞中的分布。四、结论(一)水通道蛋白3在不同时期小鼠子宫内膜及蜕膜化组织中表达1.AQP3能够负责子宫腔水分子的双向转运;2.AQP3在着床窗口期高表达,可能对于胚胎着床起正向调控作用;3.推断AQP3在蜕膜化过程无作用,但可以促进子宫锁的形成。(二)AQP3随月经周期变化及在胚胎着床中的机制研究1.AQP3在着床窗口期的人子宫内膜中表达出现峰值,并且在高接受态子宫内膜细胞系RL95-2中表达高于低接受态子宫内膜细胞系HEC-1A,提示AQP3可能作为子宫内膜接受态标志物,并且对于胚胎着床过程起到一定作用;2.AQP3通过影响子宫内膜细胞的侵袭和迁移促进胚胎着床的顺利进行,对其黏附过程无明显作用;3.雌、孕激素联合作用于子宫内膜细胞促进AQP3的表达;4.E2P4通过AQP3介导的EMT促进子宫内膜细胞的侵袭和迁移;5.AQP3和Ezrin之间存在蛋白互作,但AQP3并不影响Ezrin的表达量,而是通过细胞骨架的改变,和Ezrin蛋白的分布来影响细胞形态,从而导致EMT的发生。