第一部分 来源于Caldicellulosiruptor bescii DSM6725菌株的嗜热多聚半乳糖醛酸酶的表达、纯化和结晶学研究果胶酶是以水解半乳糖醛酸由α-1,4糖苷键聚合而成的多糖链为底物的一系列酶类的总称,它能将高分子果胶多糖有效降解为小分子片段或单体还原糖形式,在高等植物和微生物中分布甚广。根据分解方式的不同,果胶酶可以分为两大类：果胶水解酶和果胶裂解酶,水解酶是通过引入水分子水解糖苷键,而裂解酶是通过反式消去作用,断裂糖苷键。果胶酶是目前工业领域研究的热点,可以应用于各种行业,在果汁制造和造纸工业中的应用最为常见,近些年,逐渐开始应用于酿酒、饲料制造、纺织行业中。本论文研究的新型高稳定性多聚半乳糖醛酸酶属于果胶水解酶中的一类,前期工作中,我们利用PCR技术由嗜热细菌Caldicellulosiruptor bescii DSM6725中获得果胶酶基因ACM61449 (E.C.3.2.1.67),现已知该基因类属于糖苷水解酶28家族。将目的基因插入到pET20b(+)载体中；转化大肠杆菌后筛选并鉴定阳性重组菌,对阳性重组菌进行诱导表达,生产重组酶蛋白CbPelA;该重组蛋白的生物学性质已经被表征,最适温度分别为72℃,最适pH分别为5.2, CbPelA最大反应速率为386.8 U/mg-1,具有良好的热稳定性,半衰期分别长达14h,薄层层析和粘度系数下降实验证实该酶为外切酶,该果胶酶活性只特异性针对多聚半乳糖醛酸,对CMC、Avicel、葡聚糖、木聚糖、壳聚糖、可溶性淀粉等其他多糖类皆没有活力。一价离子Na-、K+、NH4+对酶促反应影响较小；大多数二价金属离子Mg2+、Zn2+、Ca2+、Ba2+、Co2+、Ni2+都对CbPelA的酶促反应有不同程度的抑制,其中Cu2+,Cd2+完全抑制CbPelA酶活力,为了深入研究该蛋白的结构与功能关系,如活性中心,底物结合,底物特异性和热稳定性,我们对CbPelA进行结晶学研究。本论文在重组表达目的蛋白CbPelA后,应用亲和、离子交换、分子筛等层析方法对重组酶实施纯化；对纯化好的蛋白用晶体试剂盒进行初步筛选。经琼脂糖凝胶电泳显示,在PCR退火温度58℃条件下成功扩增得到1300bp左右目的蛋白基因片段；对筛选得到的阳性克隆中重组质粒的测序结果显示,我们成功获得了同基因组数据库中一致的多聚半乳糖醛酸酶基因序列；经Ni-NTA、Resource Q Superdex 200纯化最终可获得纯度达到95%的目标蛋白10mg/mL,进一步用Crystal Screen HR2-110和Crystal Screen 2 HR2-112晶体试剂盒对其进行初步筛选,显微镜下发现Crystal Screen HR2-11026号：0.2M乙酸铵、0.1M柠檬酸三钠盐二水合物pH5.6、30% 2-甲基-2,4-戊二醇,培养液中有少量蛋白晶体出现,透明度较好,我们进而对该晶体进行了优化,在其他条件不变的条件下,分别改变pH和沉淀剂量进行精细筛选,于160℃进行培养观察,目前该部分工作仍在进行。第二部分HIV-1 Vif介导的E3泛素化酶复合物的表达、纯4化和结晶学研究人类免疫缺陷病毒1(HIV-1)中病毒感染因子(Vif)蛋白是病毒编码的6个辅助蛋白之一,分子量大小为23kD,它在反转录病毒科的所有慢病毒中广泛存在。Vif蛋白在不同类型的细胞中对病毒感侵染性的影响有着很大的不同,Vif缺失株在非允许细胞中可以正常生长并分泌,然而不能进行病毒复制,导致病毒没有感染性,因此不能进行对细胞的感染。然而在允许细胞内中,病毒的复制并不依赖于Vif,即便缺失Vif基因的HIV-1病毒也能在允许细胞中成功复制,产生大量具有感染性的病毒。因此,在非允许细胞中,HIV-1 Vif蛋白在抵抗宿主天然免疫中起重要作用,它通过细胞内泛素蛋白酶降解途径来限制宿主限制因子的抗病毒活性。人体内主要的细胞表达限制性因子包括APOBEC3家族的成员,它们能够阻止HIV的复制和蔓延。该家族成员主要在病毒复制早期发挥作用,首先通过包装进入逆转录病毒,然后对逆转录病毒的负义链进行修饰,进行脱氨基作用致使病毒基因组高突变的产生,最终病毒的蛋白也相应的突变,也可能导致病毒蛋白转录提早终止。Vif蛋白对宿主天然免疫的抵制机制主要是通过形成六连体E3连接酶复合体,其中包含：Vif, CBF-β, cullin5, elonginC、elonginB和RBX蛋白,其中Vif作为各组分之间的接头蛋白。形成六连体E3连接酶复合体之后经过E3级联反应将宿主天然免疫细胞表达限制性因子A3G泛素化,再通过细胞内一系列的蛋白酶体途径将其降解。研究发现,Vif作为接头蛋白用于募集E3复合物的功能位点已被解析,E3复合物与Vif蛋白相互作用位点包括：Vif氨基端与CBF-β结合；Vif羧基端与elonginC结合,通过Vif的SOCS基序的SLQ保守位点连接；Vif还与cullin5结合,通过他的SOCS基序下游保守的HCCH基序,相互作用的复合物中cullin5蛋白作为骨架蛋白起支撑的作用、elonginB-elonginC作为调节亚基起调节作用、CBF-β作为Vif蛋白折叠的辅助因子,各组分的共同作用形成了具有活性的E3连接酶复合体[46]。然而HIV-1 Vif的结构与功能的关系还有待发现。为了了解它们之间的相互作用机制,我们构建了Vif(1-176)-CBF-β(1-165)-elonginB(1-118)-elonginC(12-112)-cullin5(1-386)-APOBEC3H(1-183)复合物。每种目的片段与不同的载体进行连接：Vif基因片段插入pET21a载体,CBF-β基因片段插入pRSF载体,ELOB-ELOC基因片段共同插入pCDF载体,CUL5基因片段插入pET28a载体,A3H基因片段插入pET28a载体。重组质粒构建成功后,pET21a-Vif,pRSF-CBF-β,pCDF-ELOB-ELOC三种质粒共转入大肠杆菌表达菌株BL21中,形成Vif-CBF-β-ELOB-ELOC(四元)共表达蛋白；而pET28a-CUL5和pET28a-A3H则分别转入大肠杆菌表达菌株BL21中。应用亲和、离子交换和分子筛等层析方法对复合蛋白进行纯化。凝胶电泳显示,在PCR退火温度54℃条件下均可成功扩增得到各自目的蛋白基因片段；对筛选得到的阳性克隆中重组质粒的测序结果显示,我们成功获得了同基因组数据库中一致的基因序列。重组蛋白首先分别经Ni-NTA柱纯化,四元、CUL5和A3H蛋白最终分别可获得纯度达到90%的目标蛋白10mg/mL,由于发现A3H单独存在条件下易沉淀,所以在经过Ni-NTA柱纯化后,立即将六种蛋白混合,一起过Resource Q、Superdex 200柱纯化,分子筛结果显示蛋白分子量大小明显大于理论分子量,推测目的蛋白以聚合的形式呈现或有部分核酸嵌入。最终经SDS-PAGE凝胶电泳显示,可看到六元复合蛋白的清晰条带并且该复合蛋白可以稳定存在。成功获得Vif-CBF-β-ELOB-ELOC-CUL5-A3H六元复合蛋白,对蛋白质的结构和功能关系的研究奠定了基础,加深我们对复合物相互作用的理解,同时对人类关注的HIV疾病的治疗提供了新的前景。