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背景和目的前列腺癌(Prostate Cancer,PCa)是男性最常见的泌尿生殖系统恶性肿瘤,我国发病率虽低于欧美地区,但呈逐年增长趋势。约15%的Pca患者确诊时已处于进展期或出现远处转移,这类患者的基础治疗方案是雄激素剥夺治疗(Androgen deprivation therapy,ADT)。但很多患者在ADT治疗一段时间后都出现激素抵抗,并进展为去势抵抗型前列腺癌(castration resistant prostate cancer,CRPC),预后差。以多西紫杉醇为基础的化疗方案是指南推荐治疗CRPC的一线方案,但几个疗程治疗后出现化疗耐药仍不可避免。Nitrogen permease regulator-like2(NPRL2)基因是本课题组一直研究的抑癌候选基因,我们前期意外发现NPRL2在PCa和CRPC组织和细胞中呈异常高表达,而在正常良性前列腺组织中却呈低表达甚至不表达的状态,并与PCa临床分期以及Gleason评分成正相关,还发现NPRL2高表达能促进PCa细胞生长,并降低多西他赛对PC3细胞的细胞毒性。同时研究发现NPRL2能影响自噬相关蛋白LC3-II/I、p62的表达,增强自噬。课题组前期验证NPRL2在前列腺癌中与mTORC1信号通路的关系,发现该基因能下调mTORC1信号通路中效应蛋白p-mTOR、p-S6K的表达,抑制mTORC1信号通路。NPRL2在CRPC细胞中高表达,NPRL2能增强自噬并抑制mTOR通路,而mTOR通路负向调节自噬,因此,我们设想NRPL2通过mTOR信号途径调控自噬参与去势抵抗性前列腺癌对多西他赛耐药。方法1.为研究多西他赛耐药,首先需要建立稳定耐多西他赛的CRPC细胞模型。通过不同浓度的多西他赛间断诱导培养前列腺癌细胞6个月,建立稳定耐多西他赛CRPC细胞(LNPER-DR和PC3-DR),CCK-8法检测化疗耐药和非化疗耐药CRPC细胞在10nmol/l多西他赛中的细胞增殖率,流式细胞术检测化疗耐药和非化疗耐药CRPC细胞在10nmol/L多西他赛中的细胞凋亡率。2.为研究NPRL2对耐多西他赛CRPC细胞的生长及与自噬的相关性,通过Western blotting检测化疗耐药CRPC细胞和非化疗耐药CRPC细胞中NPRL2、自噬相关蛋白和mTOR相关蛋白的表达,激光共聚焦显微镜计数耐药和非耐药细胞中LC3荧光小点的数量变化,透射电镜拍摄耐药和非耐药细胞中自噬小体的数量变化。沉默NPRL2和/或抑制自噬后,CCK-8法检测化疗耐药和非化疗耐药CRPC细胞在10nmol/L多西他赛中的细胞增殖率,流式细胞术检测化疗耐药和非化疗耐药CRPC细胞在10nmol/L多西他赛中的细胞凋亡率,Western blotting检测化疗耐药和非化疗耐药CRPC细胞中自噬有关蛋白(LC3-II、LC3-I和p62)的表达差别。3.为探索NPRL2参与CRPC耐多西他赛的机制,通过沉默NPRL2和/或抑制mTOR后,CCK-8法检测干预后各组细胞在10nmol/L多西他赛中的细胞增殖率,流式细胞术检测干预后各组细胞在10nmol/l多西他赛中的细胞凋亡率,Western blotting检测干预后各组细胞中NPRL2、mTOR相关蛋白和自噬相关蛋白的表达差别,激光共聚焦显微镜计数干预后各组细胞中LC3荧光小点的数量改变,透射电镜拍摄干预后各组细胞中自噬小体的数量改变。4.最后构建裸鼠成瘤模型,利用沉默NPRL2的耐药细胞株进行动物实验,观察沉默NPRL2后是否增加耐多西他赛CRPC细胞对多西他赛的敏感性。结果1.在前期已经建立LNPER-DR模型基础上,通过多西他赛连续诱导建立了耐多西他赛PC3细胞模型(PC3-DR),CCK-8证明两种耐药细胞在10nmol/L多西他赛中细胞增值率高于非耐药组,流式细胞术证明两种耐药细胞在10nmol/L多西他赛中凋亡也高于非耐药组。2.Western blot结果显示,在LNPER-DR和PC3-DR细胞中NPRL2的表达量明显高于在LNPER和PC3细胞中的表达量,对应的自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比例增高、p62降低,mTOR相关蛋白p-mTOR、p-s6k降低,提示LNPER-DR和PC3-DR细胞中NPRL2过表达,自噬增强,mTOR通路减弱。免疫荧光和电镜也证实LNPER-DR和PC3-DR细胞中自噬明显增强。沉默NPRL2或抑制自噬后增加了多西他赛对耐药细胞的敏感性,自噬流实验显示自噬流通畅。3.mTOR抑制剂torin1能降低NPRL2沉默的多西他赛耐药细胞株对多西他赛的敏感性,沉默NPRL2能影响多西他赛耐药细胞mTOR信号通路,并抑制自噬,而NPRL2沉默的耐药细胞使用mTOR抑制剂能增强自噬,证明NPRL2通过mTOR信号通路参与调控多西他赛耐药细胞株的自噬。4.沉默NPRL2后能明显抑制多西他赛干预下LNPER-DR裸鼠的皮下瘤体生长速度和瘤体大小,Western blot结果显示沉默NPRL2的LNPER-DR细胞瘤体中mTOR通路表达加强,自噬受到抑制,结果与细胞实验一致。结论NPRL2通过mTOR调控自噬参与CRPC多西他赛耐药。靶向调控NPRL2可提高CRPC的化疗敏感性或延长化疗耐药时间。