茶是我国重要的经济作物之一,近年来茶产业迅速发展,茶树种类品种及规模增加,但在提高农业生产效益的同时也引发一些健康和环境问题。目前,茶树病害防治主要是以化学药剂防治为主,易造成农药残留和环境污染等问题。研究茶树对病害防御机制和内源相关抗病基因筛选,对茶产业的发展具有重要意义。本研究从云抗10号茶树基因组中筛选出28条几丁质酶基因序列,以黔湄601和梅占为材料进行几丁质酶基因克隆,并进行生物信息学分析、表达量分析、遗传多样性分析以及构建毕赤酵母表达载体进行抗菌活性分析,为茶树抗真菌研究提供基础数据。1茶树几丁质酶基因克隆与分析本研究基于云抗10号茶树基因组中筛选出28条几丁质酶基因,用黔湄601和梅占为材料,进行茶树几丁质酶基因序列的同源克隆。最终同源克隆获得5条几丁质酶基因序列,分别命名为CsC7、CsC8、CsC13、CsC21、CsC23。保守结构域分析结果表明,CsC7、CsC21属于几丁质酶18家族,CsC13属于几丁质酶19家族,CsC8有肽酶S8家族结构域和纤连蛋白III型结构域。CsC23有肽酶S8家族结构域和抑制剂I9结构域。对所获得的几丁质酶序列进行二级结构和信号肽等生物信息学分析,从NCBI数据库中查找出其他植物的几丁质酶,与同源克隆所得出的几丁质酶基因序列进行聚类分析,为进一步研究基因的特异性表达提供线索。由进化树聚类分析发现,CsC21与动物几丁质酶同源性较高,推测该基因可能不属于植物几丁质酶,在后续试验中不再对该基因进一步研究。2茶树几丁质酶基因表达及多态性分析在黔湄601和梅占接种病原菌后0 h、24 h、7 d、8 d和9 d取样,提取总RNA后反转为cDNA,使用Realtime-PCR对CsC7、CsC8、CsC13和CsC23在两个品种中接种病原菌后不同时期的相对表达量进行分析。结果表明,CsC7与CsC13在两个品种中的相对表达模式相似,黔湄601在接菌后7 d CsC7与CsC13相对表达量最高分别是0 h的3.7倍和7.5倍;在梅占中接种病原菌后7 d CsC7与CsC13相对表达量最高,分别是0 h的157.5倍和59.3倍。CsC8在黔湄601中接种病原菌后表达量接种7 d相对表达量最高,是0 h的19.1倍,第9 d表达量被抑制;在梅占中接种病原菌后相对表达量24 h相对表达量最高,是0 h的41.7倍,9 d时表达量被抑制。CsC23在黔湄601中接种病原菌后表达量被抑制;在梅占中接种病原菌后第7 d,相对表达量最高是0 h的40.4倍,第8 d时表达量下降是0 h的4.3倍,第9 d时表达量上升至0 h的29.2倍。36个不同茶树品种中有28个品种扩增出CsC13基因,胶回收测序后其核苷酸序列长度在768-794 bp范围,与序列比对分析发现,核苷酸序列相似度为91%-99.23%,单个碱基变异位点有32个,其中发生颠换的位点有13个,占40.63%;发生转换的位点有14个,占43.75%;插入或缺失位点有5个,占15.63%。多个核苷酸变异位点有5个。氨基酸序列比对发现,5个氨基酸位点完全一致,分别是20位（L）亮氨酸、21位（P）脯氨酸、81位（I）异亮氨酸、196位（P）脯氨酸和244位（K）赖氨酸。基于核苷酸序列与氨基酸序列分别构建进化树发现,均可将29个品种分为5组,每组品种对茶饼病的抗性都有不同,说明CsC13基因不能将茶树对茶饼病的抗性准确区分开。3 CsC13基因抗菌活性分析将含有CsC13基因的pPIC9K诱导型表达载体,经化学转化将载体转入毕赤酵母GS115感受态细胞中,获得阳性转化子GS115-pPIC9K-CsC13工程菌。经诱导发酵培养96 h,取GS115-pPIC9K-CsC13菌体破碎上清、菌体破碎沉淀、发酵上清液和毕赤酵母GS115发酵上清液用于SDS-PAGE蛋白电泳检测,结果显示在GS115-pPIC9K-CsC13酵母菌体破碎沉淀和菌体破碎上清液中都有清晰目的蛋白条带。在抑菌试验中发现,添加GS115-pPIC9K-CsC13上清液对3种真菌都有一定抑制作用,对尖孢镰刀菌的抑制作用最高抑制率为40%,对厚孢镰刀菌抑制率为28%,对黄曲霉抑制作用较低为抑制率为10.4%,对哈茨木霉没有显著抑制作用,成功获得对真菌生长具有一定抑制作用的工程菌株GS115-pPIC9KCsC13。