奶牛在泌乳过程中由于高的营养需求和代谢水平,通常伴随着一氧化氮(NO)等自由基类代谢产物的增加,进而加剧其炎症反应,引起产奶性能和乳品质的降低。壳聚糖具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎等生物学活性,在食品、制药、猪禽养殖等领域的应用较为广泛。有限的研究资料报道,壳聚糖可提高奶牛的抗氧化功能与抗炎症反应,但其机制尚不清楚。鉴于此,本论文研究了日粮添加壳聚糖对奶牛产奶性能、抗氧化功能和抗炎症反应的调节作用,并结合体外法以奶牛外周血单个核细胞(PBMC)为模型、通过NO和脂多糖(LPS)诱导PBMC的氧化损伤,利用基因沉默技术从NF-κB信号通路深入研究了壳聚糖对奶牛抗氧化功能与抗炎症反应的调节机理,为通过日粮调控奶牛的抗氧化能力、提高产奶性能和改善乳品质提供理论依据。论文分为7个试验:试验1采用完全随机试验设计,将40头高产奶牛根据泌乳天数(200±15d)、产奶量(34.80±4.95kg/d)、胎次(2-3胎)等相近的原则随机分为五个日粮处理组,每个处理组8头,包括对照组(CON)和壳聚糖组C500、C1000、C1500和C2000,CON组饲喂不添加壳聚糖的基础日粮,壳聚糖组分别在基础日粮中添加500、1000、1500、2000 mg/kg(干物质基础)的壳聚糖,每天记录采食量、产奶量,在试验期的第0、2、4、6、8周收集牛奶样品用于分析乳品质,试验期的第60天尾静脉采血分离血清和PBMC用于分析血液抗氧化及免疫功能。结果表明:日粮中添加壳聚糖,提高了奶牛的干物质采食量、产奶量、能量矫正乳、乳蛋白和乳糖产量,降低了奶牛的体细胞指数;对抗氧化能力和免疫功能的促进作用呈剂量依赖性,可显著提高血清中血清超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)活性,降低丙二醛含量;显著增加淋巴细胞中CD4+和CD8+的比例,CD3+的比例和CD4+/CD8+比值均呈上升趋势。日粮添加壳聚糖对奶牛血清NO含量的降低呈剂量依赖性,显著降低了 iNOS活性,白介素1β(IL-1β)的含量呈下降趋势;显著或趋于显著地降低了 PBMC的IL-1β、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的基因与蛋白质的表达;显著降低了 NF-κBp65的蛋白磷酸化水平。综合多项指标,日粮中添加壳聚糖可以促进奶牛的产奶性能、抗氧化能力和免疫功能,其中1500mg/kg的壳聚糖具有较好的促进效果。提示壳聚糖调节奶牛抗氧化能力和免疫反应的机制可能与抑制NF-κB信号通路、降低了 iNOS活性,从而减少了过量的NO产生有关。试验2采用单因素随机试验设计,将体外分离得到的PBMC随机分为5组,一是对照组(CON)组,细胞培养液中不添加COS;其余4组为COS40、COS80、COS160和COS320组,分别在细胞培养液中添加40、80、160和320μg/mL的壳寡糖(COS),研究体外添加COS对奶牛PBMC抗氧化功能和炎症因子含量的影响。结果表明,体外添加COS对PBMC抗氧化功能的促进效果呈剂量效应,可增强抗氧化酶CAT、SOD的活性,其中以160 ug/mL的COS具有较好的效果。COS可抑制炎症因子IL-1β、白介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)的产生,降低iNOS的活性与NO的含量,并呈现剂量依赖性,以160μg/mLCOS具有较好抑制作用,320μg/mLCOS的抑制作用减弱。添加COS抑制了 NF-κBp50和NF-κBp65的基因表达,提示COS可能通过抑制NF-κB信号通路活性,降低iNOS与炎症因子的基因表达,降低了 NO的生成,进而促进了抗氧化功能,降低了炎症因子的产生。试验3利用二乙烯三胺/一氧化氮聚合物(DETA/NO)建立了 PBMC体外氧化损伤模型,将细胞培养于终浓度为0、50、100、200、300、500 μmol/L的DETA/NO细胞培养液中,分别作用2、4、6、8、12 h。结果显示,200 μmol/LDETA/NO作用PBMC4h,可以作为建立PBMC氧化损伤模型的适宜条件,NO过量引起PBMC氧化损伤,抗氧化能力降低,炎症因子IL-1β、NO含量上升。试验4采用单因子完全随机的设计,将分离得到的PBMC随机分为1个对照组(CON组)和4个COS组。其中,CON组在无COS、但含有DETA/NO的培养基中进行处理;COS40、COS80、COS160和COS320组分别在添加40、80、160和320μg/mL COS培养基中预处理,再用DETA/NO继续处理。结果显示,COS对NO诱导的PBMC抗氧化功能的降低具有显著的减缓效果,降低了炎症因子IL-1β、IL-6和TNF-α的释放,抑制了 NF-κB通路活性,且具有剂量依赖性。其中,以160μg/mL的COS具有较好的抑制效果,320μg/mLCOS抑制效果减弱。提示COS可能通过抑制IL-1β产生降低NF-κB的通路活性,从而抑制iNOS的活性及NO的产生发挥其对细胞抗氧化功能的促进作用。试验5包括两个部分,第一部分首先以细胞活力为指标筛选LPS的损伤时间和剂量,采用单因素完全随机试验设计,LPS浓度包括0、0.1、1、10和20μg/mL 5个不同的LPS浓度处理,其中以0μg/mL剂量组为对照组(CON),LPS作用于细胞的时间包括6、12和24h,筛选可诱导奶牛PBMC细胞损伤的适宜的LPS损伤浓度和作用时间。结果显示,10μg/mL的LPS作用24h可以作为建立LPS诱导PBMC氧化损伤模型的适宜条件。第二部分试验采用单因子完全随机试验设计,将分离的PBMC分为6个处理组:对照组(CON),不进行COS和LPS处理;LPS组,只进行 LPS 处理;CL40、CL80、CL160 和 CL320 组分别接受 40、80、160 和 320μg/mL的COS处理,之后用LPS处理。结果表明,LPS可以诱导PBMC发生氧化应激,NF-kBp65的磷酸化水平增加,导致抗氧化功能降低,促炎因子的基因与蛋白质表达增强。COS对由LPS诱导引起的奶牛PBMC氧化损伤具有剂量依赖性的保护作用,可提高抗氧化酶谷胱甘肽过氧化物酶和SOD活性,降低IL-1 β、IL-6、TNF-α等促炎性因子的含量与NO的生成,以160μg/mL的COS有较好的保护效果。提示COS可能通过调节NF-κB信号通路影响iNOS活性,进而抑制NO的生成,促进奶牛PBMC的抗氧化功能与抗炎症反应。试验6是在试验1饲养试验的基础上进行的。饲养试验结束时,分别从饲喂不同剂量壳聚糖(0、500、1000、1500和2000mg/kg)的5组奶牛血液中分离PBMC。试验分为6个处理组:将上述0剂量组奶牛的PBMC样本分为2部分,一部分不进行LPS处理,为对照组;另一部分进行LPS损伤处理,为LPS损伤组;其他壳聚糖饲喂组分离得到的PBMC均进行LPS损伤,设为CL500、CL1000、CL1500、CL2000组。结果显示,未饲喂壳聚糖的对照组奶牛PBMC在LPS的诱导下引起了氧化损伤;饲喂壳聚糖的奶牛PBMC细胞对体外LPS诱导引起的氧化损伤具有减缓作用,并呈剂量效应,引起NF-κBp65的磷酸化水平降低,iNOS酶活性及其基因与蛋白质的表达降低,NO的生成降低;其中,日粮壳聚糖添加剂量以1000-2000mg/kg减缓作用较好;进一步说明壳聚糖调节奶牛抗氧化能力与抗炎症反应的机制可能与NF-κB-NO调节途径有关。试验7试验分为2部分进行,第一部分利用siRNA沉默PBMC的NF-κBp65基因,选择具有最佳沉默效果的干扰序列。结果显示,siRNA可以成功沉默奶牛PBMC中NF-κBp65的基因表达,沉默效率为61%,NF-κBp65蛋白磷酸化表达降低了 38.5%。第二部分利用siRNA对NF-κBp65基因沉默的同时,以LPS诱导PBMC的氧化损伤,添加适宜的COS,揭示NF-κBp65基因在COS缓解PBMC氧化应激损伤中的作用。试验分为8个处理组,对照组、LPS处理组、siRNA+COS+LPS组、siRNA组、COS 组、siRNA+COS 组、siRNA+LPS 组、COS+LPS 组和 siRNA+COS+LPS 组。结果表明利用siRNA沉默NF-κBp65后,降低了由LPS引起的氧化损伤程度,下调了 iNOS的基因与蛋白质的表达,促进了细胞的抗氧化应激能力,说明NF-κB是引起细胞氧化损伤的关键通路,NF-κBp65是COS调节奶牛抗氧化能力的关键基因,COS通过抑制NF-κB通路降低了 iNOS的基因与蛋白质表达,缓解了由LPS诱导引起的氧化应激。综上,日粮中添加壳聚糖可以促进奶牛的产奶性能、抗氧化能力和抗炎症反应,其中以1500mg/kg的壳聚糖具有较好的促进效果;本文从NF-κBp65-NO途径诠释了其影响机制,即壳聚糖通过抑制NF-κB通路降低了 iNOS的基因与蛋白质表达,降低了 NO的过量生成,抑制了炎症反应,促进了奶牛的抗氧化应激能力,抑制了炎症反应。