在世界上的近100个国家中,棉花是主要的经济作物。然而,自上世纪90年代初,棉花卷叶病(CLCuD)成为限制巴基斯坦和印度棉花产量的最主要因素。这种疾病已蔓延到巴基斯坦和印度整个植棉区,最近中国南方也有相关报道,尤其是自2001年以来,生产上一直缺乏高抗的棉花品种,严重影响棉花的产量和品质。野生棉尤其是亚洲棉和司笃克氏棉具有丰富的卷叶病抗性基因资源以及高强纤维等特性,是棉花育种的重要基因来源,但由于栽培的陆地棉与这些棉种间存在种间杂交障碍和种间杂种的高度不育性等,严重制约了这些基因资源的有效利用,有关利用分子标记来转育二倍体野生棉的CLCuD抗性等相关研究报道也鲜有报道。本研究拟利用四倍体栽培种陆地棉分别与两个二倍体棉种(包括A染色体组的亚洲棉和E染色体组的司笃克氏棉)杂交,通过克服种间杂交的不亲和性和杂种的不育性,与栽培品种陆地棉进行回交,创造育种中间材料,并对其杂交后代进行CLCuD抗性评价鉴定,并利用SSR分子标记进行与抗病性状连锁的分子标记发掘,为今后进行抗病分子标记辅助选择奠定基础。1.将二倍体亚洲棉的抗棉花卷叶病性状向陆地棉种转育研究(1)陆地棉与二倍体亚洲棉种间回交群体的培育陆地棉与二倍体亚洲棉种间回交群体的培育包括两种方式:一是以四倍体陆地棉CRSM-38(2n=4x=52)为母本,直接与二倍体亚洲棉 15-Mollisoni(2n=2x=26)杂交,F1染色体加倍得到六倍体,再与四倍体陆地棉回交(六倍体途径),组合名为[G.hirsutum× G.arboreum]；另一种方式是首先将二倍体亚洲棉染色体加倍,获得人工同源四倍体的亚洲棉(2n=4x=52)(四倍体途径),以该同源四倍体为母本,与四倍体棉杂交,再与四倍体棉回交,组合名为[2(G.arboreum× G.hirsutum]。为了克服种间杂交的不亲和性,采用植物激素保铃和大量杂交的方法来获得杂交种子和回交后代。在六倍体途径中,培育获得BC1群体是最具挑战性的,共进行了 12890多朵花的杂交才取得了 57粒回交种子,其次是BC2和BC3,分别进行了 1295和980多朵花的杂交。与六倍体途径相比较,四倍体途径培育获得BC1群体则更为艰难。两种途径,随着回交世代的提高,染色体的配对渐趋正常,结铃性提高,种子发芽率上升。后代表型中出现了与二倍体亚洲棉表型相似的性状,表明陆地棉与亚洲棉杂交成功,可以进行回交群体的选择。(2)陆地棉与亚洲棉种间杂种回交群体的CLCuD抗性评价。通过对[2(G.arboeum× G.hirsutum]和[G.hirsutum×G.arboreum]的的 F1 以及BC1～BC群体的CLCuD抗性评价,结果发现,F1均表现高抗,但随着回交世代的增加,其抗性下降,发病指数(DI)提高,具体表现为:群体BC1为1.3～1.6%，BC2为1.8～4.0%,BC3为4.2～7.0%,但远低于陆地棉亲本CIM-496,其CLCuD发病指数为96%。通过嫁接法鉴定,结果表明BC1-BC3群体均表现高抗。杂交组合[2(G.arboreum)× G.hirsutum]复病的潜伏期(天)较杂交组合 G.hirsutum ×G.arboreum 长。结果表明,可以通过种间杂交将二倍体亚洲棉的CLCuD抗性向四倍体陆地棉成功渐渗。2.陆地棉中来自亚洲棉的性状与SSR标记的关联分析(1)利用SSR标记对源于亚洲棉的渐渗片段的鉴定利用GGTV2.0工具来分析亚洲棉染色体片段在陆地棉中的渐渗情况。基因型图形分析结果表明,渐渗系的基因组组成中,受体的基因组恢复率达到平均为76.2%,供体的基因组组成为平均为4.3%,其余为杂合片段。来自供体第9号染色体的片段比例最高,为24.4%,受体仅为55.5%。渐渗系2、8、10和60的基因组中,有超过10%的基因组来自供体,而渐渗系1、2、8、10则表现出良好的CLCuD抗性,以及较理想的农艺性状和纤维品质。这些渐渗材料对于分子标记辅助选择很有益处。这些渐渗片段的鉴定将为今后开展育种研究、基因定位以及棉花改良奠定基础。(2)农艺性状与分子标记之间的关联分析利用单标记分析法开展了性状与标记的关联分析。结果发现有6个SSR位点与棉花卷叶病抗性存在极显著关联(0.1%水平);20个SSR位点与纤维品质关联,27个SSR位点与农艺性状极显著关联(0.01%)。这些相关位点数多于所发现的QTL数,表明可能存在假的关联。(3)棉花卷叶病抗性QTL利用IciMapping软件对BC4回交群体进行了 CLCuD抗性QTL分析,共发现5个QTL,其中2个为发病指数QTL,另3个为发病率QTL。这5个QTLs可解释的表型变异为7.6-14.6%,其LOD值为2.0-2.9。与它们关联的分子标记分别为BNL3347-140,NAU3695-280,dc40134-370,NAU3317-225 和 JESPR290-125,与单标记分析结果基本一致。(4)农艺性状QTLs利用QTL Ici Mapping软件对BC4群体进行了农艺性状QTL的分析,共发现26个QTL,涉及到12个性状,分别为:5个QTLs为SCW,FBpP和LM各3个,LpB,BS,SpL,SpB 和 SM 各 2 个,MPpP，BpP,SpB，SCpS 和 SCpL 各 1 个。解释的表型变异解释为3.8-29.0%。与QTL相关联的分子标记共13个,它们分别是:BNL3347-140,Gh369-145,Gh594-100,JESPR274-105,NAU1014-185,NAU1246-200,NAU2108-350,NAU2508-150,NAU2887-450,NAU3022-235,NAU3401-400,NAU462-650,NAU6993-130。其中,有5个标记是重迭的,对标记辅助选择有用。如:第5染色体的 BNL3347-140 和 Gh594-100 标记,分别与 LpB 和 BS、SpL,SpB，SCW,LM和SM性状相关联;类似的,标记NAU462-650与MPpP，FBpP,LpB和BS相关联,NAU2508-150 与 SpB,和 SCpL 相关联,NAU3401-400 和 FBpP,SpL,SCW,LM,SM相关联。(5)纤维性状QTL共发现6个纤维性状的QTL 15个。分别为4个衣分QTL,纤维长度整齐度和反射率各3个QTL,纤维强度和短纤维指数各2个,解释的表型变异为4.0-19.6%。涉及的分子标记有 11 个,分别为 NAU2494-215,Gh594-100,NAU2002-600,JESPR290-125,NAU2686-1250,NAU3695-280,NAU1278-270,NAU3401-400,cgr6812-150,BNL1438-120,BNL3479-220。3.利用种间杂交将司笃克氏棉的抗CLCuD性和高强纤维向陆地棉转育(1)陆地棉和司笃克氏棉种间杂交的F1六倍体的培育。利用人工去雄授粉法,在田间自然条件下开展陆地棉与司笃克氏棉的种间杂交,采用植物激素保铃,共做了 438朵花,得铃15个,仅获得28个F1种子。获得的种子利用0.03%的秋水仙素处理6个小时,种子发芽率为42.9%,获得12个苗,其中仅有4株成株,为六倍体(2n=6x=78),染色体加倍比例为33.3%。对表型(茎、叶、花、铃)为双亲中间型的F1植株进行花粉活性分析,发现51.1%花粉存在活性。花粉母细胞中期Ⅰ染色体配对行为观察表明,染色体数均为78条,其中70.3%的细胞染色体配对成39个二价体。F1花粉的活性较低,导致其F,自交结铃性较低。(2)陆地棉与司笃克氏棉种间杂种双二倍体F1的卷叶病抗性和纤维强度评价通过自然发病和嫁接接种两种方法对六倍体F1杂种进行CLCuD抗性鉴定。结果表明,在野外条件下,所有的4株原六倍体植株均没有表现病症,同时,所有的嫁接的17株也没有出现病症,显示出很强的抗病性。通过对六倍体F1的纤维特性进行了测定分析,结果表明,与推广品种MNH-886相比,F1六倍体具有更大的纤维强度(54.4 g/tex)、纤维伸长(6.7%),分别增加了34.9%和23.9%,但纤维细度较粗(5.6μg/inch),增加了 3.6%。