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废用性肌萎缩是临床上亟待解决的重要问题之一。尽管科研人员已经作了大量的研究,但目前仍未找到阻止和治疗废用性肌萎缩的有效措施,其主要的原因在于我们对废用性肌萎缩的分子机制仍缺乏了解。冬眠是冬眠动物应对冬季低温和食物缺乏等不利因素所特有的生存策略,其过程可以长达数月。在历经长期的冬眠期不活动后,冬眠动物的骨骼肌并未出现明显的废用性肌萎缩。因此,冬眠动物是一个天然的抗废用性肌萎缩研究模型。阐明冬眠动物骨骼肌这种特殊适应现象的发生机制是生理生态学领域亟待研究的重要课题,对航天、临床、运动及康复医学等领域亦有重要借鉴意义。蛋白的糖基化(glycosylation)是指将糖或者寡糖通过酶促反应连接到蛋白质上,这是蛋白质最重要的翻译后修饰方式之一。据估计,人类约70%的蛋白质被多种糖结构所修饰。越来越多的证据表明多种病理状况引起的肌肉萎缩与蛋白的糖基化密切相关。作为糖基化方式之一,O-乙酰葡萄糖胺(O-acetylglycosamine,O-GlcNAc)可以通过控制肌蛋白合成来调控废用性肌萎缩；蛋白的唾液酸化(sialylation)水平的降低是导致肌纤维降解、肌肉力量减弱及肌重减轻的重要原因之一；多种导致肌肉萎缩或功能障碍的肌肉疾病如有镶边空泡远端肌病(distal myopathy with rimmed vacuoles, DMRV)和先天性肌营养不良(congenital muscular dystrophy, CMD)均被证实与肌肉中蛋白糖基化的异常紧密相关。我们本次研究以达乌尔黄鼠(Spermophilus dauricus)为实验对象,选取典型的慢肌比目鱼肌(soleus, SOL)为代表,首次对冬眠不同时期黄鼠比目鱼肌糖蛋白组质学进行系统研究,从新的角度探讨冬眠动物骨骼肌的抗废用性肌萎缩机制。第一部分：采用凝集素芯片技术检测冬眠不同时期达乌尔黄鼠比目鱼肌中糖蛋白糖基化的变化情况,并使用凝集素组化技术对芯片结果进行验证。芯片的分析结果显示,有8种凝集素的荧光强度值在冬眠过程中发生了显著性变化,分别为马鞍树凝集素-Ⅱ(Maackia Amurensis Lectin Ⅱ, MAL-Ⅱ)、四棱豆凝集素-Ⅰ(Psophocarpus Tetragonolobus Lectin Ⅰ,PTL-Ⅰ)、紫藤花凝集素(Wisteria Floribunda Lectin, WFA)、加纳子凝集素-Ⅰ(Griffonia Simplicifolia Lectin I, GSL-Ⅰ)、四棱豆凝集素-Ⅱ(Psophocarpus Tetragonolobus Lectin Ⅱ, PTL-Ⅱ)、曼陀罗凝集素(Datura stramonium, DSA)、欧洲卫矛凝集素(Euonymus Europaeus Lectin,EEL)和菜豆凝集素-E+L(Phaseolus vulgaris Agglutinin E+L,PHA-E+L)。我们的结果显示：1)与冬眠前组相比,冬眠组凝集素MAL-Ⅱ所识别的糖链结构唾液酸(Sialic acid, SA)α2-3半乳糖(Galactose, Gal) (SAa2-3Gal)显著降低,而在激醒组和出眠组显著增加,恢复到冬眠前水平；2)PTL-Ⅰ所识别的αN-乙酰半乳糖胺(αGalNAc)和Gal结构与SAa2-3Gal的变化趋势相似,即在冬眠中显著下降,在激醒和出眠时显著增加；3)与冬眠组相比,激醒组和出眠组的WFA特异性识别的末端GalNAc (Terminal GalNAc)结构显著增加；4)与其它三组相比,GSL-Ⅰ和PTL-Ⅱ特异性识别αGalNAc和Gal结构在激醒组中显著性的增加；5)与冬眠前组相比,DSA识别的GlcNAc结构在冬眠组显著性增加,而在激醒组和出眠组显著下降,恢复到冬眠前水平；6)与其它三组相比,凝集素EEL识别的半乳糖α1-3(岩藻糖α1-2)Gal(岩藻糖,Fucose, Fuc)结构在冬眠组显著增加；7)与冬眠前组相比,冬眠组、激醒组和出眠组SOL的PHA-E+L特异性识别的三天线和四天线复杂型N-糖链(Tri-and tetra-antennary complex-type N-glycan)结构显著性增加。我们选取了MAL-II, PTL-I,DSA和PHA-E+L四种凝集素作了凝集素组化实验。组化的结果与凝集素芯片的结果相一致,进一步验证了凝集素芯片的实验结论。总之,这一部分的结果提示,黄鼠周期性阵间激醒过程中,SAa2-3Gal结构的显著性增加有效地补偿了其在冬眠过程中的减少,对于维持冬眠黄鼠骨骼肌正常的结构和功能,防止其废用性萎缩起到了重要作用；由于PTL-Ⅰ、WFA、GSL-Ⅰ、PTL-Ⅱ四种凝集素特异性识别的糖链结构均为O-连接的糖链,因此推测,O-连接的糖链在激醒过程中的增加可能与冬眠黄鼠特有的保护性机制有关；此外,三天线和四天线型的糖蛋白N-糖链在整个冬眠过程中均显著性增加,可能与黄鼠骨骼肌对冬眠废用的生理适应机制有关。第二部分：本文第二章的结果表明,黄鼠周期性阵间激醒过程中,SAa2-3Gal结构的显著性增加有效地补偿了其在冬眠过程中的减少,而正常的唾液酸含量对于维持肌肉的形态、结构、功能有着重要的作用。因此,本部分实验的研究目的是通过测定冬眠不同时期黄鼠比目鱼肌中β-半乳糖-α-2,3-唾液酸糖基转移酶(sialyltransferasebeta-galactoside alpha-2,3-sialyltransferases)(包括ST3Gall、ST3Gal2、 ST3Gal3、ST3Gal4、T3Gal5、ST3Gal6)与唾液酸糖苷酶(sialidases)(包括NEU1、 NEU2、NEU3、NEU4) mRNA表达的变化情况,从糖相关基因mRNA水平对SAa2-3Ga在冬眠不同时期的变化机制进行分析。我们的结果显示,与冬眠前组相比,冬眠组ST3Gall的mRNA表达量显著性降低(-55.00%；P<0.01),而激醒组和出眠组ST3Gall的mRNA表达量与冬眠组相比,均显著性升高(114.30%和126.20%,P<0.01),与冬眠前组相比无显著性的差异(P>0.05)。相比于冬眠前组,ST3Gal2的mRNA表达量在冬眠组显著性降低(-42.70%,P<0.01),而与冬眠组相比,激醒组和出眠组mRNA表达量均显著性升高(77.30%和76.50%,P<0.01),冬眠前组、激醒组与出眠组的ST3Gal2的mRNA表达量无显著性的差异(P>0.05)。冬眠组ST3Gal5的mRNA相对表达量相比于冬眠前组显著性降低(-60.91%,P<0.01),而在激醒组和出眠组中ST3Gal5的mRNA表达量分别较冬眠组出现显著性升高(160.56%和125.48%,P<0.01),与冬眠前组相比没有显著的差异(P>0.05)。NEU1、NEU3和ST3Gal6的mRNA表达量在冬眠四组中没有显著的差异(冬眠前组,冬眠组,激醒组,出眠组)(P>0.05)。我们的结果提示,ST3Gall、ST3Gal2及ST3Gal5 mRNA相对表达量的改变,即在冬眠中明显下降,在阵间激醒过程中和出眠后又恢复至冬眠前水平,可能是造成黄鼠SOL的SAa2-3Gal结构在冬眠期间变化的主要因素。第三部分：本文第二章的研究表明,达乌尔黄鼠比目鱼肌中凝集素MAL-Ⅱ特异性识别的糖链结构SAa2-3Gal在冬眠过程中的显著变化可能在其抗废用性肌萎缩机制中起到重要作用。因此,本部分实验制备制备凝集素MAL-Ⅱ-磁性微粒复合物,分别从冬眠前和冬眠黄鼠比目鱼肌中提取末端为SAa2-3Gal的糖蛋白,利用LC-ESI-MS/MS对提取的糖蛋白进行鉴定,通过生物信息学对鉴定的糖蛋白进行进一步分析。从冬眠前组和冬眠组中分别鉴定出糖蛋白227个和185个。其中,只在冬眠前组鉴定出的糖蛋白为141个,只在冬眠组鉴定出的糖蛋白为99个,在两组中均鉴定出的糖蛋白数为86个。GO (Gene Ontology)功能注释分析显示：根据细胞成分注释,鉴定的糖蛋白主要是胞内蛋白,并且很多为大分子蛋白质,主要分布在细胞器中和膜结构上。根据分子功能注释,这些糖蛋白具有结合、催化以及结构分子活性等方面的功能。根据参与的生物过程注释,这些糖蛋白主要涉及细胞过程、刺激应答、代谢过程以及生物调节等生物过程。KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路富集分析显示,从冬眠前组和冬眠组SOL分离出的糖蛋白显著性富集的通路分别为40条和36条,其中,只在冬眠前组显著性富集的通路有14条,而只在冬眠组显著性富集的有10条。使用IntAct数据库进行蛋白质-蛋白质相互作用分析,利用Cytoscape欠件分布构建了冬眠前组和冬眠组糖蛋白的蛋白质相互作用网络图(The protein-protein interaction network, PPI network),筛选出9个度值(degree)大于30的核心蛋白质。第四部分：本部分实验选取了2个糖蛋白进行验证,分别为热休克同源蛋白(heat shock cognate 70,HSC70)和丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK),检测冬眠过程中其蛋白表达和SAa2-3Gal结构的变化情况。此外,检测黄鼠SOL中14-3-3 protein epsilon蛋白表达在冬眠不同时期的变化情况,分析其在抗废用性肌萎缩机制中的潜在作用。我们的结果显示,与冬眠前相比,冬眠组的HSC70蛋白的表达量显著降低了37.39%(P<0.01),与冬眠组相比,激醒组的HSC70蛋白的表达量显著上升了51.39%(P<0.01),出眠组显著上升了41.67%(P<0.01),冬眠前组、激醒组和出眠组三组之间无显著性差异(P>0.05)；PK蛋白的表达在四组之间无显著性差异(冬眠前组,冬眠组,激醒组,出眠组)(P>0.05)；与冬眠前组相比,冬眠组的14-3-3 protein epsilon的表达量显著降低了42.59%(P<0.01),与冬眠组相比,激醒组的14-3-3 protein epsilon的表达量显著性上升了51.61%(P<0.01),出眠组显著性上升了58.06%(P<0.01),冬眠前组、激醒组和出眠组三组之间无显著性差异(P>0.05)；与冬眠前组相比,冬眠组糖蛋白HSC70的SAa2-3Gal结构显著减少30.08%(P<0.01),与冬眠组相比,激醒组的SAa2-3Gal结构显著增加了37.66%(P<0.05),而出眠组显著性增加54.50%(P<0.01),冬眠前组、激醒组和出眠组三组之间无显著性差异(P>0.05)；与冬眠前组相比,冬眠组糖蛋白PK末端SAa2-3Gal结构显著减少29.40%(P<0.01),与冬眠组相比,激醒组的SAa2-3Gal结构显著增加了30.91%(P<0.05),出眠组显著性增加34.41%(P<0.05),冬眠前组、激醒组和出眠组三组之间无显著性差异(P>0.05)。结果表明,冬眠不同时期黄鼠比目鱼肌中HSC70、PK、14-3-3 protein epsilon三种蛋白的变化(包括蛋白表达和SAa2-3Gal糖结构)可能与其特有的抗废用性肌萎缩机制相关。