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B淋巴细胞(简称B细胞)来源于哺乳动物的骨髓,它的分化发育和功能活性受机体内各种因素的影响如解剖部位、微环境、细胞和体液免疫系统等,生理状态下B淋巴细胞对病原物产生的免疫应答过程是机体抵御病原物入侵机体免疫系统重要成员。但B淋巴细胞分化、发育或功能异常将会导致多种疾病的发生如系统性红斑狼疮(Systemic Lupus Erythematosus,SLE)、毒性弥漫性甲状腺肿(Graves)、重症肌无力(Sjogren Syndrome)、多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma,MM)、B淋巴瘤白血病等。因此对影响B淋巴细胞分化、发育和功能影响的研究将有助于深入认识此类疾病的病因并为临床的诊治提供有意义的参考依据。SLE的病因和病程与体内B淋巴细胞功能异常密切相关,临床上除了常规治疗外,目前也开展了靶向B细胞治疗,如靶向B细胞活化因子(B cell activativing factor,BAFF)的药物Belimumab,有效缓解了SLE症状并获得积极的效果,但对SLE的复发无明显效果。同样MM也是B淋巴细胞向单克隆恶性浆细胞异常分化而导致单克隆球蛋白大量分泌,引起广泛骨质破坏、反复感染、贫血、高钙血症、高粘滞血症、肾功能不全等一系列临床表现。传统的化疗药物能缓解MM的症状,延长生存期,但毒副作用大;近年来的靶向治疗主要是针对骨髓微环境中MM细胞生长和生存的治疗方法,仍不能从根本上治愈疾病。BAFF作为B细胞活化正调节因子的研究已经比较多,然而对于B细胞免疫应答反应的负调节因子研究的比较少。我们以前的研究显示,BAFF的一个受体分子TACI(跨膜激活剂及钙调素配体的相互作用分子)与Ig G Fc段构成的融合蛋白即TACI-Ig G能有效阻断BAFF效应;TACI-Ig G在体内能有效地通过降低B细胞的活化从而降低分泌自身抗体的浆细胞产生和减轻SLE小鼠自身免疫症状。为了筛选B细胞活化的负调节因子,我们应用基因芯片技术分析TACI-Ig G治疗SLE小鼠的B细胞基因表达变化,结果发现阻断BAFF后,SLE的B细胞中代谢型谷氨酸受体3(Metabotropic glutamate receptor 3,Grm3)基因水平异常增高。Grm3是哺乳细胞表面上的一个抑制性分子,是代谢型谷氨酸受体Ⅱ组的一个亚型,为G蛋白偶联受体,活化后可以抑制腺苷酸环化酶系统,减少c AMP的形成。我们提出Grm3可能是B细胞表面的一个抑制性分子,它的水平异常可能与B淋巴细胞功能异常及B细胞异常相关疾病的病因和病程有关,并开展了相关的探讨性研究,期望能够为SLE和MM等疾病的研究提供一个新的视角和临床治疗的新的靶点。目的:探讨Grm3在SLE和MM的B细胞中的表达情况及其可能作用机理,从而为Grm3干预SLE和MM提供新的理论及实验依据,为其治疗提供一新的潜在靶点。方法与结果:一、B细胞的Grm3表达水平与SLE的相关性1.利用基因芯片技术在TACI-Ig G治疗SLE小鼠B细胞中筛选B细胞活化负调节因子,发现阻断BAFF后,SLE的Grm3基因水平异常增高。2.进一步在动物水平,利用SLE模型小鼠进行TACI-Ig G治疗,通过Realtime-PCR和WB方法检测B细胞中Grm3表达变化,结果显示:与正常的小鼠相比,Grm3在SLE模型小鼠中B细胞表达明显下降。当用TACI-Ig G治疗SLE模型小鼠后,B细胞中Grm3 m RNA和蛋白表达上调。3.收集临床SLE患者和MS患者血液样品,用Real-time-PCR和WB方法检测SLE和MS患者外周血B细胞中Grm3的表达变化情况,结果显示:Grm3在SLE和MS患者B细胞中表达下降。4.为了明确Grm3是否在B细胞中特异性表达,用Real-time-PCR和WB两种方法分别检测巨噬细胞、中性粒细胞、自然杀伤细胞、T细胞、树突状细胞、B细胞等不同细胞群中Grm3 m RNA和蛋白表达情况,结果发现:Grm3主要表达在B细胞中,而其它免疫细胞中表达呈较低水平。5.为了进一步明确Grm3在处于不同发育分化阶段的B细胞中的表达情况,用Real-time-PCR和WB方法检测初始B细胞(CD19+B220+CD138-GL7-)、活化的B细胞(GL7+B220+)和浆细胞(CD138+B220+)中的Grm3表达水平,结果显示:Grm3主要表达在初始B细胞中,而在浆细胞及活化B细胞表达较低。6.为了进一步验证Grm3与B细胞活化及向浆细胞分化的关系,我们应用Blimp-1(决定浆细胞产生的关键转录因子)和Bcl6(决定活化B细胞即生发中心B细胞产生的关键转录因子)慢病毒表达载体感染小鼠B细胞,结果显示:Blimp-1和Bcl6过表达能够抑制Grm3的表达。7.为了研究Grm3对B细胞增殖的影响,应用Grm3-sh RNA慢病毒转染方法敲低B细胞上Grm3,结果显示:Grm3敲低的B细胞对LPS的反应增加。8.进一步探讨Grm3对B细胞增殖的影响,我们检测了Grm3激动剂LY379268对B细胞增殖的影响。细胞增殖分析提示:Grm3激动剂能够抑制由LPS诱导的B细胞增殖,而Grm3敲低后,Grm3激动剂将不能抑制LPS对B细胞的反应。9.为了再次验证以上的结论,用同样的方法检测另一种Grm3激动剂LY341495以及Grm3拮抗剂对B细胞的影响,发现Grm3激动剂LY354740也能够减少B细胞的数目,而Grm3拮抗剂增加B细胞的数目。10.为了检测Grm3在SLE疾病中的作用,在SLE小鼠体内注射Grm3激动剂后,用ELISA检测小鼠体内c AMP浓度、抗ds-DNA抗体的滴度,FACS检测总B细胞、GL7+及Ig G+B细胞的比例,按照BCA蛋白定量试剂盒操作说明书定量尿蛋白,结果提示:Grm3激动剂降低c AMP浓度、抗ds-DNA抗体的滴度,降低总B细胞、GL7+及Ig G+B细胞的数目,降低蛋白尿水平。另外肾脏经切片并HE染色,发现与对照处理SLE小鼠相比,激动剂处理的SLE小鼠肾间质基本没有炎性细胞浸润,肾小球间隙恢复正常。以上结果提示Grm3可以有效的缓解SLE小鼠自身免疫症状。二、Grm3表达水平与骨髓瘤细胞系SP2/0凋亡相关性在我们前面的研究中,已证实了Grm3可表达于B细胞表面,靶向Grm3可有效的治疗SLE小鼠。那么Grm3在B细胞相关的肿瘤如多发性骨髓瘤或B细胞淋巴瘤中又有何种作用呢?为此,我们采取了两种具有代表性作用的细胞系:Nalm-6(人前B淋巴白血病细胞系)和SP2/0(小鼠的骨髓瘤细胞系),前者可作为研究B细胞分化成浆细胞的细胞模型,后者可作为异常浆细胞的细胞模型,在此两种细胞系上进行了相关研究,方法与结果如下:1.通过FACS,检测SP2/0和Nalm-6细胞株Grm3和CD138表达情况,发现SP2/0表达CD138,Nalm-6不表达CD138,SP2/0和Nalm-6均有Grm3的表达,但Grm3不表达在CD138+SP2/0。进一步采用Annexin V和PI来标记凋亡细胞,结果提示Grm3表达在Annexin V+/PI+的Nalm-6和SP2/0细胞表面,而活细胞并不表达Grm3,Grm3主要表达在凋亡的中期相中。2.为了探讨凋亡对Grm3表达的影响,首先使用FK506来诱导细胞的凋亡。通过FACS发现FK506能够有效的诱导SP2/0细胞的凋亡,经过Real-time-PCR和蛋白电泳进一步的证实了这一结论。FACS还发现FK506诱导SP2/0细胞凋亡是呈剂量依赖性的。而在人胚肾细胞293T细胞中,FK506不能诱导Grm3的表达,这也再次验证了我们前期的结论,即Grm3主要表达在B细胞中。另外FACS发现抗肿瘤药如nocodazole和monastrol均能有效的诱导细胞的凋亡及Grm3的表达。3.为了验证Grm3在细胞凋亡中的作用,首先体外实验观察敲低Grm3对细胞凋亡的影响。采用Grm3 sh RNA包装的慢病毒敲低SP2/0细胞中Grm3的表达,通过FACS提示Grm3的敲低可以抑制SP2/0细胞的凋亡,而且也能够降低由FK506、rapamycin、monastrol、nocodazole等药物所诱导的SP2/0细胞的凋亡。4.在体内实验观察敲低Grm3对细胞凋亡的影响时,采用了皮下移植瘤的方法。选取了Balb/c小鼠及裸鼠,分别皮下注射转染有Grm3-sh RNA或对照sh RNA的SP2/0细胞,结果显示Grm3的敲低可加快Balb/c小鼠及裸鼠的肿瘤发展,肿瘤的体积及重量较对照组有所增大。5.为了进一步验证Grm3在细胞凋亡中的作用,采用Grm3过表达的方法观察Grm3对细胞凋亡的影响。将带有EGFP的表达Grm3的慢病毒及对照慢病毒转入SP2/0细胞,采用FACS分析带EGFP标签的细胞的凋亡情况,结果显示Grm3的过表达能够增加细胞的凋亡。6.以往的研究表明Grm3能够抑制c AMP信号,而c AMP-PKA能够磷酸化Foxo1,因此为了探讨Foxo1对细胞凋亡的影响,用脂质体转染方法过表达Foxo1,FACS提示Foxo1能够导致SP2/0细胞凋亡增加;然后为观察Foxo1敲低对细胞凋亡的影响,采用Foxo1 sh RNA包装的慢病毒转染方法敲低Foxo1,FACS提示FK506诱导的SP2/0细胞凋亡被抑制。然后我们在Foxo1敲低的小鼠中,观察FK506或Bortezomib诱导的细胞凋亡的影响,FACS提示Foxo1敲低后,FK506或Bortezomib诱导的细胞凋亡被抑制。结论:根据前期的工作基础,我们发现了一个新的与B细胞分化发育相关的基因-Grm3。Grm3在SLE等自身免疫病B细胞中表达降低,通过活化Grm3能够减轻小鼠的SLE的症状,拮抗Grm3后能够通过增加B细胞的数目加重SLE症状。Grm3也参与了抗肿瘤药物诱导小鼠骨髓瘤细胞系SP2/0的凋亡过程:主要表达于细胞凋亡的中期,Grm3敲低能够抑制细胞凋亡,Grm3的过表达能够加重细胞凋亡。我们的研究结果表明,Grm3作为一个抑制性分子通过抑制自身免疫病中B细胞的扩增来抑制自身免疫病的症状,作为B细胞凋亡的一个调节分子抑制骨髓瘤细胞系SP2/0体内成瘤。这项研究为实验室结果进行临床验证即Grm3在SLE和MM患者B细胞异常分化为浆细胞中的作用奠定了基础,为Grm3作为SLE和MM等相关疾病的干预靶点的可行性提供理论及实验依据。