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铁皮石斛Dendrobium officiaLe Kimuraet Migo.始载于《神农本草经》,为我国名贵中药,具有益胃生津、滋阴清热的功效,主治热病伤津,胃痛干呕,肺热干咳,腰膝酸软等症。现代药理学研究,铁皮石斛具有抗肿瘤、抗氧化、降血糖、提高免疫力等生理活性。铁皮石斛自然环境下繁衍率低,再加上无节制的采摘,曾一度濒临枯竭。目前,铁皮石斛人工栽培技术愈发成熟,在全国各大产区(主要分布于我国浙江、云南、广西、广东、福建、江西等地)已形成了较大规模种植。由于不同种源、不同的地理、气候环境等因素的影响,容易造成铁皮石斛成分及含量上的差异。课题组前期对不同产区铁皮石斛进行HPLC特征图谱的分析,根据特征图谱的差异性及规律性,初步提出了“丹霞地貌种”、“浙江本地种”、“铁皮兰种”的种源概念。研究表明,不同种源主要区别为黄酮类成分。在此基础上,课题组从铁皮石斛叶中提取、分离、纯化、鉴别了新西兰牡荆苷Ⅱ、新西兰牡荆苷Ⅰ、芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-α-L-鼠李糖苷、芹菜素-6-C-α-L-鼠李糖-8-β-D-葡萄糖苷和芦丁等成分。此外,采用电子喷雾质谱联用技术(ESI/MS)从铁皮石斛茎中分离鉴别了新西兰牡荆苷Ⅱ、新西兰牡荆苷Ⅰ、夏佛塔苷、异夏佛塔苷、芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-α-L-鼠李糖苷、芹菜素-6-C-α-L-鼠李糖-8-β-D-葡萄糖苷、芦丁等多个黄酮苷类成分。因此,本研究针对铁皮石斛黄酮类成分多为异构体、分离较难的特点,采用中药HPLC特征图谱技术结合指标成分的含量测定方法,对不同种源及仿野生铁皮石斛进行分析研究,以期为铁皮石斛种源的划分提供依据。此外,比较铁皮石斛的易混淆品紫皮石斛(D.Paxt.)的差异。目的:1、优化铁皮石斛黄酮苷成分HPLC特征图谱色谱条件,为种源区域的划分提供依据;探讨仿野生样品与普通大棚栽培品HPLC特征图谱的差异性;探讨紫皮石斛与铁皮石斛黄酮类成分的差异性。2、建立铁皮石斛5个黄酮苷类成分(新西兰牡荆苷Ⅱ、新西兰牡荆苷Ⅰ、夏佛塔苷、芹菜素-6-C-α-L-鼠李糖-8-β-D-葡萄糖苷、芦丁)以及2个黄酮苷类成分(异夏佛塔苷、芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-α-L-鼠李糖苷)一测多评的含量测定分析方法,结合甘露糖、葡萄糖含量的测定,分析不同来源样品含量的差异性。方法:1、HPLC特征图谱分析采用Kromasil 100-5 C18色谱柱,以四氢呋喃-乙腈-甲醇(10:22:5)-0.05%磷酸为流动相,梯度洗脱,检测波长为340nm。结合紫外光谱、保留时间以及对照品定位对黄酮苷类特征峰进行标定;通过Ward系统聚类分析法对特征峰峰面积及个数进行种源归类。在聚类分析的基础上,采用国家药典委员会中药指纹图谱相似度软件评价系统软件(2004A版)进行相似度评价。2、采用特征图谱相同色谱条件对铁皮石斛7个黄酮苷含量进行测定,针对个别成分对照品难获得的情况,结合一测多评法(QAMS,Quality Assurance Management System)对不同种源铁皮石斛进行含量测定。3、优化柱前衍生HPLC法,测定甘露糖、葡萄糖含量。结果:1、建立的铁皮石斛黄酮苷类成分HPLC特征图谱分析方法具有可行性,主要特征峰分离度能达到含量测定的要求。(1)30批铁皮石斛共标示了 13个黄酮苷类峰,鉴别了新西兰牡荆苷Ⅱ、新西兰牡荆苷Ⅰ、夏佛塔苷、异夏佛塔苷、芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-α-L-鼠李糖苷、芹菜素-6-C-α-L-鼠李糖-8-β-D-葡萄糖苷、芦丁等7个特征峰。通过系统聚类分析法将样品分为了3大类,第Ⅰ类5批共标示8个特征峰,主要由广东韶关、江西井冈山、福建等丹霞地貌产区组成;第Ⅱ类11批共标示10个特征峰,主要由广西与云南两大产地组成;第Ⅲ类14批共标示11个特征峰,由浙江省各大产区组成。与课题组前期归类结果基本一致。(2)芹菜素-6-C-α-L-鼠李糖-8-β-葡萄糖苷、芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-α-L-鼠李糖苷为铁皮兰种(第Ⅱ类)较为专属的成分,11批样品相似度为0.749～0.980;浙江本地种(第Ⅲ类)峰10、峰12～峰13峰面积较高,14批样品相似度为0.714～0.904;第Ⅰ类丹霞地貌种芦丁峰面积较高,5批样品相似度为0.955～0.985。丹霞地貌种对照图谱与浙江本地种对照图谱和铁皮兰种对照图谱相似度分别为0.257、0.579,浙江本地种对照图谱与铁皮兰种对照图谱相似度为0.344。提示不同种源铁皮石斛黄酮苷的特征图谱存在明显差异。(3)5批丹霞地貌种仿野生样品共标示10个特征峰,相似度为0.863～0.924。仿野生样品检出的黄酮苷类特征峰更丰富,主要峰面积与大棚栽培样品差异不明显。(4)10批紫皮石斛样品共标示9个特征峰,鉴别了新西兰牡荆苷Ⅱ、新西兰牡荆苷Ⅰ、夏佛塔苷、异夏佛塔苷和芦丁等5个特征峰,其中峰Z1～Z3为紫皮石斛与铁皮石斛不一致的特征峰。10批样品相似度为0.929～0.987;紫皮石斛对照图谱与铁皮兰种、浙江本地种和丹霞地貌种相似度分别为0.206、0.413和0.550,提示紫皮石斛与铁皮石斛黄酮苷类成分存在明显差异性。2、建立了铁皮石斛5个黄酮苷类成分以及2个黄酮苷类成分的一测多评含量测定方法,方法可行。(1)建立了夏佛塔苷与异夏佛塔苷的相对校正因子s1、芹菜素-6-C-α-L-鼠李糖-8-β-D-葡萄糖苷与芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-α-L-鼠李糖苷的相对校正因子s2,分别为1.009和1.004。(2)新西兰牡荆苷Ⅱ的回归方程为Y=1770.7X+11.105,线性范围为0.00925～1.85μg,r=1.0000;新西兰牡荆苷Ⅰ的回归方程为Y=1889.5X+5.476,线性范围为0.00843～1.686μg,r=1.0000;夏佛塔苷的回归方程为Y=2046.5X+14.891,线性范围为0.00714～1.428μg,r=0.9999;芹菜素-6-C-α-L-鼠李糖-8-β-D-葡萄糖苷的回归方程为Y=1719.5X-4.402,线性范围为0.1195～2.39μg,r=0.9999;芦丁的回归方程为Y=1202.7X+11.916,线性范围为 0.0165～3.3μg,r=1.0000。(3)芹菜素-6-C-α-L-鼠李糖-8-β-D-葡萄糖苷和芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-α-L-鼠李糖苷为铁皮兰种较为专属的成分,11批样品含量分别为0.0422～0.232 mg/g、0.0154～0.138 mg/g,同批次样品,芹菜素-6-C-α-L-鼠李糖-8-β-D-葡萄糖苷含量约为芹菜素-6-C-β-D-葡萄糖-8-α-L-鼠李糖苷的1～3倍。新西兰牡荆苷Ⅱ、新西兰牡荆苷Ⅰ、夏佛塔苷与异夏佛塔苷为铁皮石斛共有成分,5批丹霞地貌种源样品含量分别为 0.0206～0.1126mg/g、0.0100～0.1298mg/g、0.0023～0.0234mg/g 和0.0026～0.0268mg/g:11批铁皮兰种样品分含量分别为0.0349～0.1113mg/g、0.0052～0.0563mg/g、0.0012～0.0123mg/g 和 0.0016～0.0133mg/g;14 批浙江本地种样品含量分别为 0.021～0.1055mg/g、0.009～0.0548mg/g、0.0055～0.0308mg/g 和0.0066～0.0416mg/g。丹霞地貌种芦丁含量明显较高,为0.2828～0.6068mg/g,浙江种次之(除两批分别为0.1558mg/g和0.2432mg/g外,12批样品芦丁含量为0.02～0.0972mg/g),铁皮兰种较低(0.0083～0.106mg/g)。(4)9批紫皮石斛中新西兰牡荆苷Ⅱ、新西兰牡荆苷Ⅰ、夏佛塔苷、异夏佛塔苷、芦丁含量分别为 0.0181～0.0426mg/g,0.0139～0.0491mg/g,0.0077～0.0307mg/g,0.0107～0.400mg/g,0.0369～0.1924mg/g。结果表明,紫皮石斛这5个成分与铁皮石斛差异不明显。3、不同种源铁皮石斛甘露糖、葡萄糖含量具有一定差异性。(1)5批丹霞地貌种甘露糖含量(Cm)和葡萄糖含量(Cg)分别为8.82%～24.44%、0.74%～9.09%,甘露糖和葡萄糖之和(Cm+g)为9.56%～32.68%,甘露糖和葡萄糖峰面积比(Am/Ag)为2.59～12.36;10批铁皮兰种Cm和Cg分别为17.43%～36.19%、4.24%～18.39%,Cm+g为 21.67%～54.58%,Am/Ag为 1.97～4.26;10 批浙江本地种 Cm和Cg 分别为 10.42%～36.40%、1.38%～9.47%,Cm+g 为 12.67%～39.78%,Am/Ag 为 1.40～9.29。研究结果显示,不同种源的多批次样品中甘露糖与葡萄糖含量、两者峰面积比值相差范围均较大,铁皮兰种含量相对较高,但种源差异规律不明显。(2)5批仿野生样品Cm和Cg分别为15.59%～20.67%、5.30%～18.03%,Cm+g为23.83%～33.62%,Am/Ag为0.90～3.63。与丹霞种源栽培品有一定差异,葡萄糖含量相对较高。结论:1、铁皮石斛黄酮苷类成分HPLC特征图谱分析方法准确可行,能达到种源的快速鉴别的目的。同时,可用于易混淆品紫皮石斛的鉴别。2、7个黄酮苷类成分含量测定方法可行,为铁皮石斛质量的研究提供了一定的依据。3、不同种源铁皮石斛甘露糖、葡萄糖含量范围相差较大,但差异规律不明显。4、仿野生铁皮石黄酮苷类成分更为丰富,且多糖含量较高。