研究背景及目的甲状腺癌是内分泌系统最常见的肿瘤,其发病率在世界范围内逐年增加。分化型甲状腺癌(differentiated thyroid cancer,DTC)约占甲状腺癌的90%,包括乳头状甲状腺癌(papillary thyroid carcinoma,PTC)和滤泡状甲状腺癌(follicular thyroid carcinoma,FTC)。131碘(131I)治疗分化型甲状腺癌在临床得到了广泛的应用。但约10%的DTC患者在其疾病自然进程中,或者进行131I治疗过程中,出现病灶摄碘能力的下降或者消失,导致131I的治疗效果降低。临床所见的低分化甲状腺癌(poorly differentiated thyroid carcinoma,p DTC)或失分化甲状腺癌(anaplastic differentiated thyroid carcinoma,ATC)多为DTC失分化形成。DTC一旦发展为p DTC甚至ATC,其摄碘能力逐渐降低,对放疗和化疗的敏感性也逐渐降低,且更容易发生远处转移导致预后较差。因此早期诊断p DTC/ATC复发和远处转移,显得尤为重要。但是,目前还没有理想的诊断p DTC/ATC复发和远处转移的方法。18F-氟代脱氧葡萄糖(2-Florine-18-Fluoro-2-deoxy-D-glucose,18F–FDG)对DTC复发和转移灶的诊断效能差异很大,且受到很多因素的影响。随着其它正电子显像剂如N-[18F]氟甲基胆碱(18F-fluoromethylcholine,18F-FCH)及1H-1-(3-[18F]氟-2-羟基丙基)-2-硝基咪唑(18F-fluoromisonidazole,18F–FMISO)的出现,这些显像剂是否能提高PET/CT在p DTC/ATC的综合诊断效能目前研究尚少。本研究拟制备p DTC/ATC细胞和动物模型,进行多种正电子显影剂的PET/CT显像,评价不同正电子显像剂对p DTC/ATC的综合诊断效能。期望能够找到对p DTC/ATC的综合诊断效能较高的正电子显像剂,以更好指导临床的治疗决策。本研究分为以下三个部分:一、建立低/失分化甲状腺癌叠加炎症动物模型,为多种正电子显像剂PET/CT动物显像做准备。以人甲状腺乳头状癌K1细胞为研究对象,经低剂量131I辐射制备低/失分化细胞模型;在裸鼠右腋部皮下种植低/失分化甲状腺癌细胞,成功制备低/失分化甲状腺癌裸鼠模型后,在其右侧大腿肌肉间注射无菌松节油,建立低/失分化甲状腺癌叠加炎症裸鼠模型。二、测定18F-FDG、18F-FCH和18F-FMISO在低/失分化甲状腺癌叠加炎症裸鼠模型体内的生物学分布,比较三者在肿瘤组织和炎症组织中的分布情况,选出特异性较强的显像剂,以期用于后续的显像研究;并对甲状腺癌组织摄取18F-FCH的机制进行初步探讨。尾静脉注射18F-FDG后60 min、注射18F-FCH后30min和注射18F-FMISO后90 min后处死裸鼠,取瘤体、炎症组织及多器官称重并测定放射性计数,研究各显像剂在荷瘤裸鼠体内的生物学分布(%ID/g);用RT-PCR和Western Blot检测裸鼠p DTC/ATC组织和正常甲状腺组织Chok和Ch AT m RNA及蛋白的表达水平。三、18F-FDG、18F-FCH和18F-FMISO在低/失分化甲状腺癌叠加炎症裸鼠模型PET/CT显像研究及18F-FDG和18F-FCH在低失分化甲状腺癌中的临床应用研究。尾静脉注射18F-FDG、18F-FCH和18F-FMISO后用Simens Truepoint Biography 64PET/CT显像系统进行各组正电子显像剂PET/CT显像,观察18F-FDG、18F-FCH和18F-FMISO在低/失分化甲状腺癌叠加炎症裸鼠体内的PET/CT显像情况,初步评价三者在低/失分化甲状腺癌叠加炎症动物模型中的诊断价值;并分析了一组临床诊断为低/失分化甲状腺癌患者的18F-FDG和18F-FCH PET/CT显像。初步探讨18F-FDG和18F-FCH对低/失分化甲状腺癌的综合诊断效能。材料和方法 一、低/失分化甲状腺癌叠加炎症动物模型的建立和鉴定以人甲状腺乳头状癌K1细胞为研究对象,经低剂量131I辐射制备低/失分化细胞;在裸鼠右腋部皮下种植低/失分化甲状腺癌细胞,构建低/失分化甲状腺癌裸鼠模型后,在其右侧大腿肌肉间注射无菌松节油,制成低/失分化甲状腺癌叠加炎症裸鼠模型。1.用740 k Bq的131I溶液对人甲状腺乳头状癌K 1细胞分别辐射0 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h后进行处理,用γ计数器测定各组细胞的放射性计数,选择细胞放射性计数下降最快的辐射时间点。用平板克隆形成试验评价K1细胞经过低剂量131I作用后增殖能力的变化。用Western Blot测定TSHR、NIS和TPO表达水平的改变评价细胞的分化程度。2.在裸鼠右腋部皮下种植低/失分化甲状腺癌细胞,观察细胞成瘤情况;移植4周后在同一只裸鼠右侧大腿肌肉间注射无菌松节油,24 h后观察右侧大腿的肿胀情况;随机选取6只荷瘤裸鼠处死,观察瘤体和炎症组织的大体和病理变化。二、多种正电子显像剂在p DTC/ATC叠加炎症裸鼠体内的生物学分布及肿瘤组织摄取胆碱的初步机制研究观察18F-FDG、18F-FCH和18F-FMISO在低/失分化甲状腺癌叠加炎症裸鼠模型体内生物学分布,比较三者在肿瘤组织和炎症组织的分布情况,选出特异性较强的显像剂,以期用于后续的显像研究;并对甲状腺癌组织摄取18F-FCH的机制进行了初步探讨。1.18只p DTC/ATC叠加炎症裸鼠随机分为三组:FDG组、FCH组和FMISO组,每组6只,尾静脉分别注射18F-FDG后60 min、18F-FCH后30 min和注射18F-FMISO后90 min处死裸鼠进行生物学分布研究,分离肿瘤、炎症组织和各脏器,计算肿瘤、炎症和其他各脏器的每克组织百分注射剂量率(%ID/g),以及肿瘤对正常组织和器官的%ID/g比值(T/NT);2.用RT-PCR和Western Blot测定FCH组p DTC/ATC叠加炎症裸鼠的肿瘤组织和其正常的甲状腺组织Chok、Ch AT的m RNA和蛋白的表达水平。三、18F-FDG、18F-FCH和18F-FMISO在低/失分化甲状腺癌叠加炎症裸鼠模型PET/CT显像研究及18F-FDG、18F-FCH在低失分化甲状腺癌患者中的临床应用研究。1.27只p DTC/ATC叠加炎症裸鼠随机分成3组:FDG组、FMISO组和FCH组进行三种显像剂PET/CT显像,每组9只。尾静脉分别注射18F-FDG、18F-FCH和18F-FMISO后用Simens Truepoint Biography 64 PET/CT显像系统进行各组正电子显像剂PET/CT显像,观察18F-FDG、18F-FCH和18F-FMISO在p DTC/ATC叠加炎症裸鼠体内的PET/CT显像情况,初步评价三者在p DTC/ATC动物模型中的诊断价值,及肿瘤与炎症组织的鉴别诊断价值。2.对2013年5月至2014年5月收治的21例p DTC/ATC患者的PET/CT显像进行分析,所有21例患者均在一周内进行了18F-FDG和18F-FCH PET/CT显像。对每种正电子显像剂的PET/CT图像均进行半定量分析,计算病变区域淋巴结转移灶的SUVmean;根据病理结果计算18F–FDG和18F-FCH对p DTC/ATC颈部及纵隔淋巴结转移诊断的灵敏度和特异性,初步探讨18F-FDG和18F-FCH对低/失分化甲状腺癌的综合诊断效能。统计学分析:采用SPSS19.0统计软件,各组之间均数的比较采用配对t检验,率的比较采用卡方检验,以P<0.05为有统计学意义。结果 一、低/失分化甲状腺癌叠加炎症动物模型的建立和鉴定1.实验组6组细胞经放射性131I(740 k Bq)照射3 h、6 h、12 h、24 h、48h和72 h后,换液再培养72 h后,和空白对照组一起处理:加入3.7 k Bq的Na I溶液0.5ml培养处理后,采用井型γ计数仪器测定1min各组的放射性计数(cpm/min)。分别计算6组各个时间点的放射性计数/空白对照组放射性计数比率。3 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h各个时间点的比率分别为:89.375±9.32、82.35±5.9、72.55±8.08、49.49±5.08、44.22±10.33和30.67±5.39。随着低剂量131I辐射时间的延长,K1细胞摄131I能力逐渐下降(3 h与对照组比较,P=0.045),从6h-24h时,K1细胞摄131I能力迅速下降(24 h与对照组、3 h、6 h、9 h比较,P均<0.001),24 h后,K1细胞摄131I能力下降幅度逐渐变缓(24 h与48 h比较,P=3.03)。采用平板克隆形成实验测定低剂量131I辐射24 h后,K1细胞的增殖能力。辐射24 h组再培养15天后,克隆形成率为(90.13±7.76)%;而对照组为(74.60±6.96)%。配对t检验,t=2.579,P=0.02;两组比较差异有统计学意义,提示辐射24 h的K1细胞的增殖能力高于未经辐射组。Western Blot测定低剂量131I辐射24 h后K1细胞内和未经辐射的K1细胞内,三种甲状腺特异性蛋白TSHR、NIS和TPO的表达情况。两组K1细胞均有TSHR蛋白、NIS蛋白和TPO蛋白的表达,但是与对照组比较,辐射24 h组的表达水平明显减少。图像经分析软件处理后,辐射24 h组TSHR、NIS和TPO相对于β-actin的表达水平分别为:0.34±0.025、0.25±0.02和0.37±0.01,而对照组K1细胞TSHR、NIS和TPO相对于β-actin的表达水平分别为:0.52±0.02、0.45±0.03和0.63±0.02。两组比较P均<0.001。K1细胞经过低剂量131I辐射24 h后,三种具备有分化型甲状腺癌特征的蛋白的表达均降低了,提示经过低剂量131I辐射24 h后,K1细胞向低/失分化甲状腺癌细胞转化。以上结果提示低剂量131I辐射24 h后成功制备PDTC细胞模型。2.45只裸鼠右侧腋部皮下接种低剂量131I辐射24 h后的K1细胞14 d后,全部长出直径约4.5 mm的瘤结节,肿瘤体积≥45 mm3,自第21 d开始肿瘤生长迅速,体积为259.14±35.82 mm3(跟7d比较,P<0.001),28 d肿瘤的平均体积≥500 mm3,肿瘤长径约17 mm。移植瘤早期为圆形或者椭圆形,之后瘤体变得不规则,部分结节融合,瘤体表面凸凹不平。移植瘤生长28 d后,麻醉并心脏采血后处死,见移植瘤位于裸鼠右腋部皮下,部分包膜不完整,和周围组织粘连,大体可见移植瘤呈结节融合的不规则状,平均约19.0 mm×8.2 mm,切面为灰白色。组织切片见大量异形细胞团,可见较多核分裂相。右大腿炎症区可见局部肿胀,皮温增高。镜下可见肌肉组织有大量的中性粒细胞浸润。经过组织病理学证实低/失分化甲状腺癌叠加炎症模型成功,为分化型甲状腺癌低/失分化的诊断和治疗提供了研究基础。二、多种正电子显像剂在p DTC/ATC叠加炎症裸鼠体内的生物学分布及肿瘤组织摄取胆碱的初步机制研究1.对三组p DTC/ATC叠加炎症模型裸鼠采血后处死,分别分离移植瘤、心脏、肺脏、肾脏、肝脏、脾脏、肌肉及炎症组织,冲洗干净,用纱布擦拭干净,迅速称重和测量放射性计数,依次计算移植瘤和心脏、肺脏、肾脏、肝脏、脾脏、肌肉及炎症组织等组织和器官的%ID/g。①FDG组在p DTC/ATC裸鼠体内的%ID/g从高到低依次为:肿瘤>心肌>肾脏>炎症组织>脾脏>肝脏>肺脏,18F-FDG在血和肌肉中摄取都较低;FCH组依次为:肝脏>肾脏>肿瘤>心脏>炎症组织>肌肉,18F-FCH在脾脏和血液中摄取较低;FMISO组依次为:肾脏>肝脏>心脏>肺脏,18F-FMISO在肿瘤和炎症组织中摄取较低;FDG组肿瘤/血、肿瘤/肌肉、肿瘤/肺脏及肿瘤/炎症组织的%ID/g比值(T/NT)均>2,而FCH组中肿瘤/血、肿瘤/肌肉和肿瘤/炎症的%ID/g比值(T/NT)>2;而FMISO组肿瘤/血、肿瘤/肌肉、肿瘤/肺脏和肿瘤/炎症的%ID/g比值(T/NT)均小于2;②FDG组瘤体%ID/g明显高于FCH组和FMISO组(P均<0.01),而FCH组高于FMISO组瘤体%ID/g(P<0.05);③FDG组炎症组织%ID/g明显高于FCH组和FMISO组(P均<0.01),而FCH组和FMISO组炎症组织的%ID/g没有差别(P>0.05);④FDG组和FCH组、FDG组和FMISO组以及FCH组和FMISO组在肿瘤/血、肿瘤/肌肉、肿瘤与肺脏的%ID/g比值(T/NT)差别均有统计学意义(P值均小于0.01)。在肿瘤/炎症%ID/g比值(T/NT)中,FCH组>FDG组>FMISO组,且FCH组跟FDG组和FMISO组比较都有统计学意义(P值均<0.05)。但是FDG组跟FMISO组没有差别(P>0.05)。2.FCH组裸鼠甲状腺癌组织和正常甲状腺组织均有Chok和Ch AT m RNA表达。跟正常对照组比较,甲状腺癌组的m RNA表达水平明显增加。图像经分析软件处理后,甲状腺癌组织Chok和Ch AT m RNA相对于β-actin的表达水平分别为:0.53±0.17和0.50±0.15;而正常甲状腺组织Chok和Ch AT m RNA相对于β-actin的表达水平分别为:0.28±0.09和0.27±0.08。两组比较P值分别为PChok=0.001、PCh AT=0.011。FCH组裸鼠甲状腺癌组织和正常甲状腺组织均有Chok和Ch AT蛋白的表达,跟正常对照组比较,甲状腺癌组的表达水平明显增加。图像经分析软件处理后,甲状腺癌组织Chok和Ch AT蛋白相对于β-actin的表达水平分别为:0.42±0.14和0.49±0.16;而正常甲状腺组织Chok和Ch AT蛋白相对于β-actin的表达水平分别为:0.27±0.09和0.29±0.08。两组比较P值分别为PChok=0.014、PCh AT=0.023。三、18F-FDG、18F-FCH和18F-FMISO在低/失分化甲状腺癌叠加炎症裸鼠模型PET/CT显像研究及18F-FDG和18F-FCH在低/失分化甲状腺癌中的临床应用研究。1.18F-FDG、18F-FCH和18F-FMISO三种显像剂PET/CT显像情况:①在PET/CT显像图上移植瘤部位摄取18F-FDG和18F-FCH,其中18F-FDG摄取>18F-FCH,18F-FMISO未见明显摄取;炎症组织均摄取三种显像剂。移植瘤摄取18F-FDG、18F-FCH和18F-FMISO的SUVmean分别约7.58±1.05、3.19±0.38和1.05±0.41,经配对t检验差别均有统计学意义(18F-FDG组与18F-FCH组,18F-FDG组与18F-FMISO组,18F-FCH组与18F-FIMSO组t值分别为3.139,6.274和9.981,P值分别均<0.001)。而炎症组织的放射性摄取从高到低分别为:18F-FDG>18F-FCH>18F-FMISO,炎症组织摄取18F-FDG、18F-FCH和18F-FMISO的SUVmean分别约4.11±0.63、1.01±0.51和0.95±0.28,经两两配对t检验后,18F-FDG组与18F-FCH组,18F-FDG组与18F-FMISO组,18F-FHC组与18F-FIMSO组t值分别为3.235,6.138和10.21,P值分别为P<0.001、P<0.001和P>0.05);②除肿瘤和炎症组织摄取外,18F-FDG PET/CT显示18F-FDG在裸鼠脑、肾脏和肝脏部位的摄取有显著升高;18F-FCH PET/CT显示18F-FCH在裸鼠肾脏和肝脏部位的摄取有显著升高;18F-FMISO PET/CT显示18F-FMISO在肝脏和肾脏部位的摄取均有显著升高。③三组显像剂肿瘤与肌肉SUVmean比值(T/NT)从高到低分别为:FDG组>FCH组>FMISO组,FDG组与FCH组,FDG组与FMISO组、FCH组与FIMSO组t值分别为6.214,10.159和6.842,P值分别为P>0.05、P<0.001和P<0.001);三组显像剂肿瘤与肺SUVmean比值(T/NT)从高到低分别为:FDG组>FCH组>FMISO组,FDG组与FCH组、FDG组与FMISO组、FCH组与FIMSO组t值分别为7.245,10.365和5.968,P值分别为P<0.001、P<0.001和P>0.05);三组显像剂肿瘤与炎症组织SUVmean比值(T/NT)从高到低分别为:FCH组>FDG组>FMISO组,FCH组与FDG组、FDG组与FMISO组、FCH组与FIMSO组t值分别为7.124,9.982和6.358,P值分别为P<0.001、P>0.05和P<0.001)。2.21例低/失分化甲状腺癌患者均在首诊DTC后经手术病理诊断证实均为乳头状癌。颈部超声、18F-FDG PET/CT显像及18F-FCH PET/CT显像结果均和病理结果比较。在21例患者中,颈部超声检查阳性为14例(66.7%),阴性病灶7例(33.3%)。在14例阳性患者中,真阳性7例,假阳性7例。在7例阴性患者中,真阴性5例,假阴性2例。18F-FDG PET/CT在21例患者中显像阳性为13例(61.9%),阴性病例8例(38.1%)。在13例阳性患者中,真阳性8例,假阳性5例。在8例阴性患者中,真阴性7例,假阴性1例。在真阳性组8例患者中,6例出现了局部复发和/或颈部和纵隔淋巴结的转移;4例出现远处转移,其中2例局部复发合并远处转移。18F-FDG PET/CT显像总的灵敏度和特异性分别为88.9%和58.3%。阳性预测值为61.5%,阴性预测值为87.5%。18F-FCH PET/CT在21例患者中显像阳性为6例(28.6%),阴性病例15例(71.4%)。在6例阳性患者中,真阳性5例,假阳性1例。在15例阴性患者中,真阴性11例,假阴性4例。所有真阳性5例经过术后或者穿刺病理证实;假阳性1例,穿刺病理为淋巴结炎症。真阳性组5例患者均为局部复发和/或颈部和纵隔淋巴结的转移。18F-FCH PET/CT显像总的灵敏度和特异性分别为55.6%和91.7%。阳性预测值为83.3%,阴性预测值为73.3%。18F-FDG在低/失分化甲状腺癌区域淋巴结转移的SUVmean为6.37±1.98,在肺转移灶的SUVmean为6.21±2.59,在骨转移灶的SUVmean为7.08±3.29,在区域淋巴结炎症的SUVmean为2.09±0.89。18F-FCH在低/失分化甲状腺癌区域淋巴结转移的SUVmean为2.14±0.57,在区域淋巴结炎症的SUVmean为0.57±0.25。2种显像剂在低/失分化甲状腺癌区域淋巴结转移的SUVmean差别有统计学意义,t值为4.56,P值<0.001。2种显像剂在低/失分化甲状腺癌区域淋巴结炎症的SUVmean差别有统计学意义,t值为2.15,P值为0.01。结论1.采用低剂量的131I辐射分化型甲状腺癌细胞系的方法制备的p DTC/ATC模型,从一定程度上模拟了131I治疗过程中甲状腺癌失分化的过程,而且细胞增殖能力及甲状腺特征性蛋白表达的变化都符合甲状腺癌低/失分化的特征。在裸鼠皮下移植p DTC/ATC细胞并给予炎症刺激,首次成功制备了p DTC/ATC叠加炎症裸鼠模型,并经病理学证实,该模型可满足PET/CT显像的需要。2.p DTC/ATC摄取18F-FCH与低/失分化甲状腺癌肿瘤细胞中的Chok胆碱磷酸化通路和Ch AT胆碱乙酰化通路相关的m RNA和蛋白水平的过量表达有关,提示在p DTC/ATC中不仅存在胆碱的磷酸化通路的激活,还有胆碱乙酰化的参与。3.18F-FDG在诊断p DTC/ATC复发或转移方面具有较高的灵敏度,但是特异性较差。18F-FCH可能是18F-FDG PET/CT显像的有益补充,还需要进一步扩充病例研究。4.18F-FMISO PET/CT在诊断p DTC/ATC与18F-FDG和18F-FCH比较无明显优势。