目的:体外分离、培养小鼠骨髓间充质干细胞(mouse Bone marrow mesenchymal stem cells,mBMSCs),并诱导其向成骨细胞方向分化,检测Oct-4在mBMSCs诱导分化前后的表达及甲基化状态的改变,为进一步研究Oct-4在BMSCs增殖分化中的作用提供研究思路。方法:采用全骨髓贴壁筛选法体外培养、扩增mBMSCs。用CD29、CD44、c-Kit以及CD34免疫细胞化学染色鉴定mBMSCs。取第3代小鼠BMSCs,用含10%FBS,0.1μmol/L地塞米松,50μg/ml维生素C和10mmol/Lβ?甘油磷酸钠的高糖DMEM培养基定向诱导mBMSCs向成骨细胞分化,并用碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, AKP)染色、茜素红染色等方法进行鉴定,同时用体外分离培养的成骨细胞作阳性对照。采用RT-PCR及间接免疫荧光染色方法,从mRNA和蛋白水平检测Oct-4在mBMSCs成骨诱导分化前后的表达;运用甲基化特异PCR检测Oct-4在mBMSCs诱导分化前后的甲基化状态。结果:mBMSCs接种24h后已大量贴壁并伸展开;48h后贴壁细胞明显增多并分裂增殖,贴壁细胞呈梭形或成纤维细胞样形态。传代培养后,细胞形态更加均一,增殖加快,呈涡旋样生长。免疫细胞化学染色和间接免疫萤光染色结果显示第3代mBMSCs CD29、CD44、c-Kit表达阳性,CD34表达阴性。第3代mBMSCs在成骨诱导诱导剂诱导4天后细胞形态变化,随着诱导时间的延长,细胞逐渐增大,细胞形态由长梭形逐渐变为多角形。mBMSCs诱导10d后大多数细胞和体外培养成骨细胞形态相似,均呈AKP和茜素红阳性反应。RT-PCR结果与间接免疫荧光染色结果同时显示,第3代的mBMSCs有Oct-4表达,而向成骨方向诱导10d后的mBMSCs及小鼠成骨细胞均未见Oct-4表达;MSP结果显示,mBMSCs在向成骨方向诱导10天后,Oct-4基因的启动子区的CpG岛出现甲基化,而未诱导的第3代mBMSCs为非甲基化状态。结论:1.在本实验室成功的建立了小鼠成骨细胞培养体系。2.成功分离培养mBMSCs,并诱导其向成骨细胞分化,观察到Oct-4在mBMSCs定向诱导分化中表达下调。3.首次观察到在mBMSCs定向诱导分化中Oct-4基因的甲基化状态发生了改变,提示Oct-4基因在mBMSCs定向诱导分化中的表达下调可能与其启动子区甲基化有关。