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结直肠癌是目前人类最常见的恶性肿瘤之一,手术治疗仍为目前主要治疗方式,但临床上近一半的结直肠癌患者在实施根治性手术之前就出现微转移,这无疑是结直肠癌患者术后转移与复发的直接原因。同源盒基因HOXB7定位于染色体17q21.3,包含183个核苷酸组成的高度保守的同源异型盒序列,编码一种具有同源框DNA结合结构域的蛋白质,在人体和哺乳动物的多种组织器官中均有不同水平的表达。本研究从检测HOXB7蛋白在正常结肠、结直肠癌组织中的表达开始,检测六种结肠癌细胞株中HOXB7 m RNA的表达情况,利用RNA干扰技术抑制或增强结肠癌HCT116、Caco2、SW620、Lo Vo细胞中HOXB7 m RNA的表达,并通过平板细胞克隆形成实验、MTT活力、细胞周期及凋亡、Transwell迁移实验、基于Matrigel胶的侵袭实验等检测HOXB7基因在体外对结肠癌细胞增殖、迁移、侵袭能力的作用,并在裸鼠皮下种植瘤和尾静脉注射转移瘤模型中进一步观察HOXB7基因对结肠癌细胞侵袭、转移能力的影响。本研究共分三部分:(1)HOXB7蛋白在人结直肠癌组织中的表达;(2)HOXB7对人结肠癌细胞增殖、凋亡的影响;(3)HOXB7对人结肠癌细胞侵袭、转移能力的影响。第一部分HOXB7蛋白在人结肠癌组织中的表达目的检测HOXB7蛋白在正常结肠、结直肠癌组织中的表达,分析临床病理学特征,初步探讨其表达水平在人结直肠癌中的意义。方法(1)收集327例临床结直肠癌病人手术切除肿瘤组织标本制作成组织芯片,应用免疫组织化学(IHC)方法检测HOXB7蛋白的表达,分析其与结直肠癌的p TNM分期、病理分级、淋巴结转移能力、脉管侵犯等临床病理特征的相关性。(2)应用Western blot方法检测结肠癌、癌旁组织及正常结肠黏膜新鲜组织中HOXB7蛋白的表达。结果(1)免疫组织化学染色结果显示,在327例结肠癌及24例正常组织内,有70.03%(229/327)的结直肠癌组织呈现HOXB7高表达。(2)HOXB7蛋白表达水平与肿瘤分化程度(P=0.000)、肿瘤侵犯脉管(P=0.004)、淋巴结转移(P=0.001)、远处转移(P=0.005)、p TNM分期(P=0.002)均有显著的相关性。(3)Western Blot检测发现HOXB7蛋白在人结肠癌新鲜组织中的表达显著高于正常肠粘膜组织。结论与正常结肠组织相比,人结肠癌中HOXB7蛋白呈异常高表达,且与肿瘤分化程度、肿瘤侵犯脉管、淋巴结转移、肿瘤远处转移、p TNM分期均有显著的相关性。第二部分HOXB7对人结肠癌细胞增殖、凋亡的影响目的探讨HOXB7对人结肠癌细胞增殖、凋亡的影响。方法(1)用实时荧光定量PCR和Western blot检测六株人结肠癌细胞株中内源性HOXB7的表达。(2)构建pc DNA3.1-HOXB7质粒和HOXB7 sh RNA重组质粒载体,与HCT116、Caco2、SW620、Lo Vo细胞分别进行瞬时转染,各分二组:空载质粒转染组、目的基因转染组,检测转染效率并筛选出有效的质粒。(3)检测各组细胞平板克隆形成能力、MTT细胞活力,细胞周期、凋亡的变化。结果(1)六种人结肠癌细胞中,Caco-2细胞中内源性HOXB7 m RNA表达和蛋白表达水平最高,HCT 116、SW620细胞中内源性HOXB7 m RNA表达和蛋白表达水平均处于中等水平,Lo Vo细胞表达最低。(2)选择Caco2、HCT116、SW620细胞筛选出有效的sh RNA质粒,与转染空载质粒的同组细胞相比,sh RNA HOXB7质粒(序列GCCTCACGGAAAGACAGATCA)则有效地抑制了Caco2、HCT116、SW620细胞中HOXB7 m RNA的表达,而pc DNA3.1-HOXB7质粒有效地增强了Lo Vo、HCT116细胞中HOXB7 m RNA的表达。(3)与各组对照组细胞相比,转染HOXB7 sh RNA质粒的Caco2、HCT116、SW620细胞以及转染pc DNA3.1-HOXB7质粒的Lo Vo、HCT116细胞,其细胞平板克隆形成能力均无明显差异,MTT细胞活力亦未受到明显改变。(5)流式检测Caco2/sh RNA、SW620/sh RNA、HCT116/sh RNA、Lo Vo/HOXB7、HCT116/HOXB7细胞周期,发现S期与M期的细胞比例没有明显改变,细胞增殖无明显差异。(6)流式检测转染HOXB7 sh RNA质粒的Caco2、HCT116、SW620细胞,与各组转染空载质粒(对照)组细胞相比,细胞凋亡水平增高,但外源性增加Lo Vo、HCT116细胞内的HOXB7基因表达水平,不能抑制细胞凋亡。结论HOXB7基因在人结肠癌细胞株中均有不同程度的表达增加,HOXB7sh RNA可有效抑制结肠癌细胞中HOXB7 m RNA的表达。增加或减少HOXB7的表达水平均不能显著影响Caco-2、HCT116、SW620细胞的增殖能力,降低HOXB7的表达,可促进Caco-2、HCT116、SW620细胞凋亡,但外源性增加HOXB7表达并不能抑制结肠癌细胞的凋亡。第三部分HOXB7基因对人结肠癌细胞侵袭、转移能力的影响目的探讨HOXB7基因对人结肠癌细胞侵袭、转移能力的影响。方法(1)将构建的pc DNA3.1-HOXB7质粒和HOXB7 sh RNA重组质粒载体,转染入HCT116、Caco-2、SW620、Lo Vo细胞,各分二组:空载质粒转染组,目的基因转染组(同第二部分),观察各组细胞Transwell迁移实验、基于Matrigel胶的Transwell侵袭实验。(2)将HCT116/Scramble和HCT116/sh RNA两组细胞,分别进行裸鼠皮下注射和尾静脉注射,观察皮下成瘤和肿瘤转移情况。结果(1)降低HOXB7水平的表达,对HCT116、Caco-2、SW620细胞的迁移及侵袭能力有明显的抑制作用,增加HOXB7水平的表达则促进Lo Vo、HCT116细胞迁移及侵袭。(2)降低HOXB7表达能抑制裸鼠皮下肿瘤的生长,肿瘤转移发生率降低。结论降低HOXB7的表达能抑制Caco-2、HCT116、SW620细胞的迁移、侵袭能力,而增加HOXB7的表达能促进Lo Vo、HCT116细胞的迁移侵袭能力,裸鼠体内皮下肿瘤形成、尾静脉注射肿瘤转移模型进一步说明HOXB7基因表达水平能影响结肠癌细胞的侵袭、转移能力。