微生物源生物化学农药是指微生物产生的可以用来防治农作物病虫草害的农用抗生素和毒素类生物制剂,主要作用于昆虫的神经系统和免疫系统,引起细胞内外物质数量和理化性质的变化,造成细胞代谢紊乱,从而导致机体死亡。微生物次生代谢产物对昆虫的致病性研究多集中在对昆虫个体影响上,但是昆虫个体差异较大、结果稳定性差。相反,以细胞系为研究材料,结果稳定性强,重复性好,细胞材料更易获取,为比较不同物种细胞对新药的敏感性提供了方便,从而提高药剂开发生产的效率。本文以草地贪夜蛾卵巢细胞(Sf9)以及粘质沙雷氏菌、球孢白僵菌和平沙绿僵菌的发酵液为材料,通过细胞形态学观察以及CCK-8法确定细胞在形态和数量上的变化,发现细胞呈现典型的凋亡特征;然后通过AO/EB法、AnnexinV-FITC/PI双染和流式细胞术检测细胞凋亡率,进一步验证了三种微生物发酵液诱导了Sf9细胞凋亡;最后通过实时荧光定量PCR分析了 Sf9细胞中凋亡相关基因的表达量差异,确定三种微生物发酵液能够诱导Sf9细胞凋亡。一、三种微生物发酵液对Sf9细胞的增殖抑制Sf9细胞系是体外表达与毒力研究常用细胞系,细胞培养技术成熟且稳定。另外Sf9细胞大小适中,直径约为15-25μm,易于观察细胞形态变化,在外界刺激下可以产生典型的细胞变化特征。因此,我们选择Sf9细胞系作为实验材料。当细胞受到外界刺激时,胞外信号传递到胞内,DNA的修复受到影响、细胞周期受阻、细胞发生凋亡,这都会使得细胞无法正常增殖从而最终死亡。三种微生物发酵液处理细胞后,在显微镜下可以观察到明显的细胞形态和数量的变化。用CCK-8法测定Sf9细胞的活力,可以间接地反应出发酵液对细胞增殖的抑制作用。本实验选用的三个菌株分别是粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)(CS2101),球孢白僵菌(Beauveria bassiana)(NJBb210)和平沙绿僵菌(Metarhizium pingshaense)。通过预实验发现,粘质沙雷氏菌发酵液最适浓度梯度在6.600-9.240mg/mL之间;球孢白僵菌发酵液浓度梯度在0.12-1.92 mg/mL之间;平沙绿僵菌发酵液浓度梯度在0.0024-0.0120 μL/mL之间。在设定的浓度梯度范围内,随着浓度的增加,细胞活力逐渐降低。利用SPSS软件分析三种微生物发酵液对Sf9细胞的增殖抑制中浓度(IC50),以及抑制中浓度的置信区间(95%),粘质沙雷氏菌、球孢白僵菌、平沙绿僵菌的增殖抑制中浓度分别为8.158(7.780-8.644)mg/mL,0.907(0.500-3.075)mg/mL,0.009(0.006-0.021)mg/mL。说明三种微生物发酵液处理细胞(细胞浓度约为5.0×106cells/mL)均对其产生了显著的增长抑制作用,且平沙绿僵菌发酵液对Sf9细胞的抑制最为明显。同时也反应出Sf9细胞对粘质沙雷氏菌的敏感性明显低于其他两个菌株。另外,通过普通光学显微镜观察细胞形态变化,发现粘质沙雷氏菌发酵液处理后,细胞数量随着浓度增加明显减少,细胞出现空泡和表面凸起并呈边缘化排列,也可以观察到细胞膜皱缩、细胞体积变小以及细胞核的颗粒化;高剂量处理下细胞大量破裂,在视野中可观察到大量细胞碎片。球孢白僵菌和平沙绿僵菌发酵液处理后,细胞增长均受到明显抑制,细胞出现皱缩和细胞核颗粒化;高剂量处理下细胞皱缩严重,仅剩下细胞印迹落于培养板底部,且在印迹上可见褐色颗粒。而与球孢白僵菌相比,平沙绿僵菌处理后的细胞除了发生皱缩,还发生变形,内陷,并分裂形成大小不等的凋亡小体。二、三种微生物发酵液诱导Sf9细胞凋亡微生物发酵液中的次生代谢产物,多为毒素、蛋白酶等,这些物质通常作用于细胞。例如粘质沙雷氏菌次生代谢产物中的溶血素,能够使血细胞裂解,血细胞在免疫中发挥着重要作用,一旦失去防御功能,昆虫便失去了屏障,最终导致机体代谢紊乱而死亡。本文在细胞增殖抑制实验的基础上,选择粘质沙雷氏菌发酵液处理浓度LD和HD分别为7.920 mg/mL(IC40)和9.240 mg/mL(IC70);球孢白僵菌发酵液处理浓度LD和HD分别为0.48 mg/mL(IC40)和1.92 mg/mL(IC70);平沙绿僵菌发酵液处理浓度LD和HD分别为0.0072 mg/mL(IC40)和0.0120 mg/mL(IC70)。然后用AO/EB、Annexin V-FITC/PI以及流式细胞仪的方法进行凋亡检测,并在荧光显微镜下观察。AO/EB法检测结果显示,粘质沙雷氏菌发酵液HD处理下凋亡率为(93.50±2.36)%;球孢白僵菌发酵液HD处理下凋亡率为(72.33±10.49)%;平沙绿僵菌发酵液HD处理下凋亡率为(75.50±6.06)%。在荧光显微镜下观察AO/EB荧光显色,凋亡细胞可以被EB着色,呈现红色荧光逐渐加强,正常细胞可以被AO着色,呈绿色荧光逐渐减弱。Annexin V-FITC/PI-流式细胞术检测结果显示,粘质沙雷氏菌发酵液HD处理下凋亡率为(46.03±1.92)%;球孢白僵菌发酵液HD处理下凋亡率为(71.73±2.76)%;平沙绿僵菌发酵液HD处理下凋亡率为(76.95±3.05)%。在荧光显微镜下观察Annexin V-FITC/PI荧光显色,晚期凋亡细胞可以被PI着色,呈现红色荧光逐渐加强,早期凋亡细胞可以被Annexin V-FITC着色,呈绿色荧光逐渐减弱。根据已报道的草地贪夜蛾中的细胞凋亡通路,以及在NCBI中搜索到的信息,选择草地贪夜蛾卵巢细胞中7个凋亡相关基因:SfDronc、SfDredd、Sf-caspase-1(Casp1)、Sf-caspase-9(Casp9)、Sf-caspase-2(Casp2)、SfIAP和Sfp53,通过qRT-PCR技术检测这些基因在mRNA水平上的表达量差异。结果显示:在粘质沙雷氏菌发酵液高剂量处理下,Sf9细胞中7个凋亡相关基因表达量均有显著上调,其中Casp9上调的倍数最高(7.2倍);低剂量处理下7个基因表达量也均显著上调。在球孢白僵菌发酵液高剂量处理下,除SfDredd和Casp2外,其余5个基因均为显著上调,其中Casp9上调的倍数最高(3.5倍);低剂量处理下,7个基因均没有显著性差异。在平沙绿僵菌发酵液高剂量处理下,除了 SfDronc没有显著性差异,其余6个基因均呈现显著上调,其中Casp2上调倍数最高(4.6倍);低剂量处理下,Casp2、Casp1、SfIAP和Sfp53显著上调,而其他基因没有显著变化。说明三种微生物发酵液处理对Sf9细胞凋亡的影响程度不一样,高剂量处理均显著上调细胞凋亡通路基因。