皱纹盘鲍(Haliotis discus hannai Ino)是我国传统的养殖经济贝类,上世纪90年代中期未知原因大规模死亡的流行给皱纹盘鲍的养殖产业造成了巨大的经济损失。从90年代中后期开始,我国鲍的养殖业普遍采用从日本引进种鲍同皱纹盘鲍杂交的方法以获得具有优良养殖性状的杂种后代进行养殖。皱纹盘鲍的日本群体和西氏鲍(Haliotis sieboldii Reeve)先后被引种进行杂交,目前在我国养殖最广泛的杂交鲍是皱纹盘鲍的日本群体同中国群体的杂交种。杂交鲍在养殖过程中向野生环境中的渗透会使引进鲍种的遗传物质向皱纹盘鲍的基因库中渗透,从而改变皱纹盘鲍野生群体的遗传结构。本研究以皱纹盘鲍的中国群体、日本群体、西氏鲍、以及皱纹盘鲍和西氏鲍的杂交和回交子代为主要研究材料,研究了皱纹盘鲍和西氏鲍的遗传背景,评价了皱纹盘鲍日本群体对中国群体遗传结构的影响,并探讨了皱纹盘鲍和西氏鲍的遗传物质在杂种后代中的扩散情况。1.皱纹盘鲍和西氏鲍微卫星标记的筛选和评价本研究利用EST文库筛查法和构建微卫星富集文库PCR扫描法分别发展了12个皱纹盘鲍和18个西氏鲍的微卫星标记。分别利用至少36个皱纹盘鲍和西氏鲍个体对这30个位点进行多态性评价,结果显示扩增得到的等位基因数目从2-13和4-14个不等,期望杂合度和观测杂合度的范围分别为0.2449-0.9311,0.1222-0.8611和0.7364-0.9117,0.3125-0.8571。通过这两种方法的筛查,我们发现:EST文库筛查法是最简便、耗费最低的方法,但是公用数据库中较少的盘鲍EST序列(1476个)和较低含量(3.4%)的微卫星DNA的数量限制了这种方式的大规模应用。而本章优化的构建微卫星富集文库筛查法由于自身的高效低耗等优点成为大量筛选微卫星标记的最好选择。2.引进的皱纹盘鲍日本群体对中国群体种群遗传结构的影响我国自上世纪90年代末期开始广泛养殖引进的日本皱纹盘鲍同中国群体的杂交鲍。这一系列的养殖行为,包括引种杂交以及频繁的苗种交换等都使土著种群的遗传完整性和持续性遭到威胁。本研究利用7个多态性的微卫星位点和411个扩增片段长度多态性位点(AFLP)评估了皱纹盘鲍日本群体对中国群体种群遗传结构的影响。结果发现了日本皱纹盘鲍的基因向本地皱纹盘鲍基因池中渐渗的强有力证据:贝叶斯聚类分析结果显示被检测的四个群体163个样本中,高达84.1%的个体都为杂交子。其中,大连、烟台和青岛地区的所有个体都是杂交子而荣成地区杂交种的比例较低(38.0%),据推测这个结果跟这些地区的养殖模式(例如网箱养殖vs底播增殖)相关。研究结果显示,由频繁的引种和杂交而导致的遗传污染已经对土著种群的基因池造成了负面的影响。鉴于保持物种的遗传多样性具有重要的意义,我们应该高度重视对这些遗传资源的鉴别、保护和利用。3.皱纹盘鲍和西氏鲍优良杂交种的培育我们利用国内本地皱纹盘鲍和从日本引进的西氏鲍为材料,采用渐渗杂交的策略建立了多代杂交鲍群体,研究了皱纹盘鲍和西氏鲍种间杂交的生物学效应。结果显示随着杂交以及选育的进行,杂交后代的受精率、孵化率和变态率得到了大幅提升,接近普通杂交鲍的水平。在稚鲍及成鲍阶段的生长速率和度夏阶段(高水温阶段)的存活率相对于普通杂交鲍也具有显著的优势。30-180日龄的自繁群体Ⅰ的壳长增长速率相对于普通杂交鲍具有显著的优势(P<0.05),壳长生长优势率在10.03%-14.31%之间,而自繁群体Ⅱ代的优势率在10.96%-15.68%之间。相对于普通杂交鲍,自繁群体Ⅰ代在3个度夏阶段存活率的优势率为20.0%-39.2%,自繁群体Ⅱ代在2个度夏阶段存活率的优势率达到25.8%-39.1%。4.皱纹盘鲍和西氏鲍及其杂交和回交子代的遗传学分析1)对皱纹盘鲍、西氏鲍及其杂交和回交子代进行了常规染色体核型和基因组荧光原位杂交(GISH)的分析。结果表明,西氏鲍、皱纹盘鲍及其杂交子代的染色体核型均为2n=20m+16sm,NF=72。利用GISH方法对皱纹盘鲍、西氏鲍及其杂交和回交子代幼虫进行了染色体检测分析,结果表明超过80%的分裂相都含有36条染色体。利用皱纹盘鲍基因组探针作杂交时,皱纹盘鲍、西氏鲍及其杂交子代分裂相中所有36条染色体均被稳定的涂染上信号,利用西氏鲍基因组探针作杂交时,也得到了同样的结果。实验过程中没有发现明显的染色体丢失、断裂及重组等现象,也没有单倍型的染色体分裂相(n=18)出现。2)利用14个微卫星位点,对皱纹盘鲍(HD)、西氏鲍(HS)、杂交子Ⅰ代(SDF1)、同皱纹盘鲍回交子Ⅰ代(SDBC1)和回交子Ⅱ代(SDBC2)五个群体进行了遗传多样性和遗传分化的分析。分析结果显示HD群体的遗传多样性比HS群体丰富,HD群体在所有的14个位点上共扩增得到195个等位基因,而HS群体共扩增得到120个等位基因。两个群体的平均观测杂合度和平均期望杂合度分别为0.5892、0.7389和0.3588、0.7806。遗传学分析均显示HD和HS群体之间有显著的遗传分化(FST=0.1935)。本研究还显示所有杂交后代的遗传多样性介于HD和HS群体之间,随着杂交以及之后同皱纹盘鲍群体的两代杂交,SDF1、SDBC1和SDBC2群体的遗传多样性逐渐增加,在统计学上同HS群体之间存在显著差异(P<0.05),同HD群体之间的分化不明显。本研究还显示通过SDF1同皱纹盘鲍群体的杂交,后代SDBC1的遗传多样性有了明显的提高,但是随着代数的增加,后代(SDBC2)群体遗传多样性的增加不明显。