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草鱼出血病是由草鱼呼肠孤病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)引起的严重危害当年草鱼鱼种的传染性疾病。无特定病原携带苗(Specific Pathogen Free,SPF)生产和疫苗免疫是对其进行防控的最有效措施。SPF因生产成本高和生产周期长等影响,制约了该项技术的发展;注射免疫受鱼种规格和操作技术等限制,也难以在渔业生产中大规模推广应用。纳米载药系统具有载药率高和极易穿透组织屏障实现药物高效转运等优点,已成为医学领域研究的热点。本研究以单壁碳纳米管(SWCNTs)为材料,采用化学修饰和分子生物学技术制备碳纳米管载药、亚单位和核酸疫苗系统;通过草鱼SPF苗种制备和浸浴免疫技术研究,评价其对草鱼出血病的防控效果;深入探索碳纳米管对鱼类细胞的跨膜和代谢作用机制,评估其对鱼类早期发育毒性。取得结果如下:1.草鱼无特定病原携带苗种研究通过抗病毒药物(三氮唑核苷和吗啉胍)的酯化修饰和碳纳米管酸化修饰,分别将抗病毒药物与碳纳米管化学连接,制备碳纳米管载三氮唑核苷(R-SWCNTs)和吗啉胍药物系统(M-SWCNTs)。高效液相色谱检测R-SWCNTs和M-SWCNTs中药物含量分别为20.45±0.36%和32.41±0.24%。通过GCRV病毒人工感染草鱼仔鱼和鱼种,并经R-SWCNTs和M-SWCNTs药浴检测其抗GCRV病毒效果,结果显示:当R-SWCNTs和M-SWCNTs处理组中药物浓度达到10 mg/L时,染毒仔鱼和鱼种存活率均达90%以上,病毒感染率降为0;而纯药物(三氮唑核苷和吗啉胍)处理浓度为20 mg/L时,染毒草鱼仔鱼和鱼种存活率仍低于35%,病毒感染率约为50%。草鱼仔鱼和鱼种药物代谢研究表明:碳纳米管载药与纯药物处理相比,药物在仔鱼体内含量提高约5倍,代谢时间延长约6倍;药物在鱼种体内含量提高约3倍,代谢时间延长约2倍。2.碳纳米管载亚单位疫苗免疫效果研究通过原核重组技术构建GCRV病毒外膜蛋白原核表达质粒(p ET32a-vp7)和菌株。经发酵和纯化技术制备重组VP7亚单位疫苗(47.8 KDa),并与酰基化碳纳米管连接制备SWCNTs-VP7亚单位疫苗系统,蛋白检测其疫苗承载率为48.9%。通过SWCNTs-VP7分别浸浴和注射免疫草鱼(0.2 g和25 g),结果显示:SWCNTs-VP7可显著增强血清抗体效价(P<0.05)、延长抗体保留时间,提高呼吸爆发、溶菌酶、补体等活性和免疫相关基因(Ig M、Ig D和MHC-I等)表达(P<0.05);免疫21 d攻毒后,两种规格草鱼在20 mg/L SWCNTs-VP7浸浴免疫的保护率均高达90%以上,与两种规格草鱼分别注射1.0μg/尾和100.0μg/尾的免疫保护率相似;而20 mg/L VP7浸浴免疫的保护率低于25%,两种规格草鱼分别注射1.0μg/尾和100.0μg/尾的保护率低于40%。由此可见,SWCNTs可提高亚单位疫苗免疫保护率,通过浸浴免疫达到注射免疫保护效果。3.碳纳米管载核酸疫苗免疫效果研究采用真核重组技术制备GCRV核酸疫苗(pc DNA-vp7),并经静电吸附作用与氨基化修饰碳纳米管进行连接,制备碳纳米管载核酸疫苗系统(SWCNTs-pc DNA-vp7)。将SWCNTs-pc DNA-vp7经注射和浸浴免疫草鱼(25 g),结果显示:SWCNTs-pc DNA-vp7可显著增强免疫抗体效价(P<0.05),延长抗体保留时间,显著提高呼吸爆发、补体、超氧化物歧化酶等活性和免疫相关基因(Ig M、CD8α和MHC-IIB等)表达(P<0.05);免疫28 d攻毒后,SWCNTs-pc DNA-vp7浸浴免疫(10 mg/L)的保护率达100%,与注射5μg/尾免疫保护率相似;而pc DNA-vp7在相同免疫剂量下保护率低于30%。因此,碳纳米管能降低核酸疫苗用量,通过浸浴免疫达到注射免疫保护效果。4.碳纳米管细胞跨膜及代谢作用研究通过荧光显像技术和流式细胞术分析荧光标记碳纳米管(F-SWCNTs)在鲤上皮瘤细胞(EPC)中的跨膜机制,结果发现:碳纳米管通过能量消耗和直接穿透两种方式共同实现细胞跨膜作用。其中前者是以网格蛋白介导的胞吞和巨胞饮来发挥主要作用,而囊膜介导的胞吞作用影响较小。采用荧光显像和拉曼光谱技术分析SWCNTs在EPC细胞中的代谢和降解过程,结果表明:SWCNTs(100 mg/L)可在0.5 h内进入细胞,2 h后含量达到24.71×10-6 pg/细胞,去除SWCNTs并每6 h更新一次培养基至48 h后,SWCNTs胞内含量降为0.47×10-6 pg/细胞;同时胞内SWCNTs的拉曼光谱D峰与G峰比值由初始的0.18上升至0.91,透射电镜观察发现SWCNTs大量出现在细胞类溶酶体结构中。上述结果说明SWCNTs可在鱼类细胞内降解和代谢,其降解与胞内类溶酶体结构有关。5.碳纳米管对鱼类安全性评价SWCNTs对稀有鮈鲫早期发育急性毒性研究发现:SWCNTs对仔鱼的144 h半数致死浓度(LC50)和半数畸形浓度(EC50)分别为140.8(109.3-174.2)和109.8(85.1-135.1)mg/L。当SWCNTs浓度在100 mg/L时,可降低仔鱼体长和心率、加快仔鱼游动速度;显著降低谷胱甘肽含量和过氧化氢酶活性(P<0.05);显著提高超氧化物歧化酶、谷胱甘肽S-转移酶、活性氧、Caspase-3、8和9活性(P<0.05);显著增加丙二醛含量和DNA损伤(P<0.05);导致hsp70、apaf-1、bcl-2、caspase-3和9基因表达显著上调(P<0.05)。荧光标记F-SWCNTs浸浴仔鱼代谢结果表明:F-SWCNTs可迅速进入仔鱼体内,但去除F-SWCNTs并代谢至144 h时仔鱼体内荧光信号消失,透射电镜观察未发现组织中有SWCNTs。上述结果说明:SWCNTs对鱼类毒性较低,并易被代谢排出体外。综上所述:碳纳米管载抗病毒药物能通过药浴阻断草鱼体内病毒传播,获得无特定病原携带苗种;碳纳米管载基因工程疫苗能通过浸浴免疫达到注射免疫效果,实现草鱼有效免疫保护。同时,碳纳米管对鱼类毒性较低,对水产动物无特定病原携带苗种生产和基因工程免注射疫苗开发具有广阔的应用前景。