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背景与目的脑卒中是目前严重危害人类健康与生命安全的常见病、难治病,根据不完全统计我国发生脑卒中的患者多达200余万/年,幸存700万余人,其中约450万患者已生活不能完全自理,患病率、病残率远高于其他发达与发展中国家,足以证明脑卒中是影响寿命的第三大杀手。临床上脑卒中主要包括缺血性与出血性脑卒中两大类,其中缺血性脑卒中较为多见。脑组织缺血可引起能量代谢障碍产生神经细胞变性、坏死、凋亡等连锁反应,甚至丧失其功能,从而导致一系列中枢神经系统症候。脑卒中及相关脑血管病(脑低灌注致记忆、认知和行为改变)可致严重认知功能障碍综合征。近些年的研究可知,造成缺血性脑损伤重要的始动因素—能量代谢障碍,其机制包括能量供应不足后引起的代谢性酸中毒、氧化应激性损伤、电解质紊乱、突触后细胞膜过度去极化、炎症反应及细胞凋亡等。文献表明,细胞能量的感受器—单磷酸腺苷活化蛋白激酶—在心脏病、肥胖、糖尿病等能量代谢障碍性疾病中发挥重要作用;哺乳动物雷帕霉素靶蛋白—证实在能量代谢障碍疾病的研究领域中同样起关键作用。小檗碱(又名黄连素),是一种存在于(小檗科等四个科十个属)繁多植物中常见的异喹啉生物碱,分子式C20H18NO4。最初提取后广泛制成清热解毒与抗菌药物应用于临床,近些年深入研究发现小檗碱可能是一种对治疗心脑血管病、高尿酸症、高脂血症、糖尿病及许多慢性炎症性疾病的药物,备受心脑系统及神经系统领域关注,但是目前对小檗碱的研究多集中在急性脑血管病及神经系统退行性病变方面,痴呆方面的研究多数集中在阿尔茨海默病(AD),对于慢性脑缺血方面的研究相对较少,小檗碱是否可以通过单磷酸腺苷活化蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(AMPK/m TOR)信号通路改善慢性脑缺血大鼠的认知功能,还不得而知。本实验采用Wistar大鼠双侧颈总动脉永久性阻断法建立2VO大鼠的慢性脑缺血模型,并给予小檗碱腹腔注射(40mg·kg-1)14天,应用Morris水迷宫试验、免疫组织化学检测法、TUNEL法、蛋白质免疫印迹法观察小檗碱通过AMPK/m TOR信号通路对慢性脑缺血大鼠认知功能的保护作用。材料与方法选取约24周龄健康雄性Wistar大鼠180只,体重约250±30g,由河南省实验动物供应中心提供,随机分为三组,分别为假手术组、模型组、干预组,每组60只,模型组与干预组应用双侧颈总动脉永久性阻断法(2VO)造模,假手术组除不结扎血管外余步骤同模型组。三组设置给药后2、4、8周三个时间点,每个时间点20只。干预组大鼠每天给予小檗碱(40mg·kg-1·d)腹腔注射14天,术后2、4、8周时,分别通过Morris水迷宫检测各组大鼠的认知功能,免疫组织化学检测大鼠海马CA1区AMPK、m TOR表达变化,TUNEL法检测大鼠海马CA1区神经元细胞凋亡,Western blot检测大鼠海马组织中AMPK、p-AMPK、m TOR、p-m TOR的表达情况。结果1.行为学观察:三个时间点相比较,随着时间延长,假手术组大鼠平均逃避潜伏期无明显变化(P>0.05);三组间同一时间点比较,干预组与模型组的平均逃避潜伏期均较假手术组显著延长(P<0.05);干预组较模型组大鼠平均逃避潜伏期显著缩短,具有统计学意义(P<0.05)。2.免疫组织化学检测结果:AMPK:假手术组三个时间点比较,免疫阳性细胞数目无明显差别(P>0.05);模型组免疫阳性细胞数目较假手术组明显减少(P<0.05);2周、4周干预组免疫细胞数目较模型组明显减少,8周时增加(P<0.05)。mTOR:假手术组大鼠各时间点比较,免疫阳性细胞数目无统计学差别(P>0.05);与假手术组相比,模型组和干预组免疫阳性细胞数目相对减少;与模型组相比,干预组免疫细胞数目明显增多(P<0.05);模型组与干预组,随着时间延长,阳性细胞数目呈递增趋势(P<0.05)。3.TUNEL法凋亡检测结果:镜下观察大鼠海马CA1区,假手术组可见极个别TUNEL标记的阳性细胞;模型组、干预组可见较多散在分布的阳性细胞,出现明显凋亡。数据处理结果:模型组和干预组与假手术组相比阳性细胞数目显著增多,差异有统计学意义(P<0.05);干预组较模型组阳性细胞减少,差异有统计学意义(P<0.05);模型组和干预组阳性细胞数组内(8周与4周、4周与2周)比较,随着时间的推移,凋亡明显加重(P<0.05)。4.Western blot结果:各组大鼠海马组织内AMPK、m TOR的表达活性采用p-AMPK/AMPK、p-m TOR/m TOR来说明。假手术组三个时间点AMPK的活性极弱,基本处于抑制状态(P>0.05),与假手术组相比,模型组与干预组p-AMPK/AMPK比值显著升高(P<0.05),与模型组相比,干预组p-AMPK/AMPK比值明显升高(P<0.05),随着缺血状态的持续,活性逐渐降低(P<0.05);假手术组三个时间点m TOR的活性无明显变化,与假手术组相比,模型组与干预组p-m TOR/m TOR比值显著减少(P<0.05),与模型组相比,干预组p-m TOR/m TOR比值明显降低(P<0.05),随着缺血状态的持续,活性进一步降低(P<0.05)。结论1慢性脑缺血状态可影响大鼠海马区AMPK、m TOR的表达,一定时间范围内,随着时间的延长,AMPK活性增加、m TOR活性降低,二者呈相互拮抗时向关系。2盐酸小檗碱可调控慢性脑缺血大鼠海马区AMPK、m TOR的表达,一定的时间范围内,表现为随着时间延长AMPK活性进一步增加,m TOR活性进一步降低。3慢性脑缺血持续状态可导致大鼠认知功能下降,应用盐酸小檗碱可改善慢性脑缺血大鼠的认知功能,其治疗机制可能是通过激活AMPK和抑制m TOR的表达。4盐酸小檗碱与AMPK/m TOR通路可为治疗慢性脑缺血所致认知功能障碍提供新的思路与方法。