论文部分内容阅读
本试验主要克隆中性氨基酸转运载体(sodium dependent neutral amino acidtransporter-2,SNAT2)以及研究SNAT2组织分布发育性变化及其介导的氨基酸感应通路和调控。 (1)通过分子克隆得到猪小肠SLC38A2基因的开放阅读框(ORF)全长1521bp,编码含506个氨基酸的蛋白,并比对后获得其与其它物种该基因的同源性信息。通过分析1~21日龄哺乳肠道SNAT2基因的组织分布和发育性变化发现SNAT2在仔猪十二指肠、空肠和回肠黏膜中均有表达,在十二指肠中表达量最高,空肠中的表达量在1和7日龄均显著低于回肠;十二指肠和空肠中SNAT2的表达呈现从1日龄到14日龄逐渐升高、随后在21日龄降低的趋势。通过检测仔猪14日龄断奶后第1、3、5和7天小肠各段SNAT2的表达发现十二指肠和空肠黏膜中SNAT2的mRNA表达水平均显著降低,但21日龄哺乳和断奶仔猪SNAT2 mRNA表达水平没有显著差异;断奶对SNAT2蛋白表达与mRNA表达水平的影响并不完全一致,断奶后第1天空肠和回肠黏膜中SNAT2蛋白表达水平显著降低。 (2)采用不同氨基酸底物体外培养肠上皮细胞发现氨基酸饥饿、精氨酸、谷氨酸或亮氨酸能诱导肠上皮细胞SNAT2的表达,而谷氨酰胺抑制其表达。抑制体外培养的肠上皮细胞SNAT2发现细胞增殖和蛋白合成显著降低。采用mTOR RT2 Profiler PCR Array分析发现SNAT2抑制后Akt1、Rps6ka4、Ddit4、Eif4ebp1、Igfbp3、Ins2、Pik3cg、Prkag3、Prkcb、Rps6ka2、Rptor和Ulk112个基因上调,Cab391、Ddit41、Irs1、Kras、Pik3r1、Rps6ka5、Rragb、Vegfb、Vegfc和Ywhaq10个基因下调,这些变化的基因大部分集中在mTORC1上游调控因子。 (3)哺乳仔猪从出生当日开始分别灌服生理盐水、腐胺、脯氨酸和NCG(N-氨甲酰谷氨酸),14日龄断奶,断奶后72小时分析发现灌服腐胺、脯氨酸和NCG仔猪显著提高日增重;灌服NCG促进了CCK的分泌,提高空肠黏膜CCK受体mRNA表达水平;灌服腐胺和NCG显著提高了空肠和回肠黏膜SNAT2的蛋白表达水平。灌服脯氨酸和NCG显著提高了空肠黏膜氨基酸转运感应相关基因(PAT1、CasR、PLCβ2和T1R3)的mRNA表达水平,NCG还显著上调了mTOR信号通路相关基因(MAP4K3和PIK3C3)的mRNA水平。