天然海鱼共附生放线菌农用活性菌株的分离、筛选及分类鉴定

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海洋覆盖全球面积的70%,蕴含丰富的海洋微生物资源。海洋来源放线菌是一类有重要价值的微生物资源,其丰富的次级代谢产物是寻找新型抗生素的重要来源。海洋鱼类作为海洋生态环境中的重要组成部分、洄游性和杂食性等生活习性使其体内富集了大量的共附生微生物,成为我们获取海洋来源微生物的载体。不同鱼种由于其生活习性(水深、食性、洄游性等)不同,其共附生微生物群落可以在一定程度上反映不同的海洋生态环境微生物群落信息。由此我们将海洋鱼类共附生微生物作为海洋微生物研究便捷的菌种来源途径。本研究以福建平潭周边海域海洋鱼类作为海洋放线菌分离来源,分离获取具有开发利用价值的海鱼共附生放线菌天然菌种。先后采用7种放线菌分离培养基以及不同的抗生素组合,共分离纯化获得海洋鱼类共附生放线菌29株。通过平板对峙法和抑制菌丝生长速率法筛选出具有抑菌活性的放线菌19株;其中,菌株030603是我们筛选得到的具有高效、广谱性抑制植物病原真菌活性的放线菌野生菌株。发酵液粗提物在0.12~6.61g/L对小麦纹枯(Rhizoctonia cerealis)等14种供试植物病原真菌具有明显的抑菌活性,其中对小麦全蚀(Ophiclus graminis)有高效抑菌活性,EC50值达到0.12g/L。进一步对分离到的29株海洋鱼类共附生放线菌进行了抗烟草花叶病毒(Tobacco Mosaic Virus, TMV)和抗肿瘤活性筛选。筛选出对烟草花叶病毒增殖的抑制率达到50%以上的活性菌株6株;通过MTT法筛选到一株抗胃癌SGC-7901高效活性野生菌株042403,在供试浓度500μg/mL下,发酵液粗提物与菌丝体粗提物抑制活性分别达97.67%和99.5%。同时,结合培养形态、生理生化实验和16S rDNA对活性菌株010204、020101、030603、042403进行分类鉴定,初步鉴定结果为假浅灰链霉菌Streptomyces pseudogriseolus 010204,球孢链霉菌Streptomyces globisporus020101,微白黄链霉菌属Streptomyces albidoflavus 030603,吸水链霉菌属Streptomyces. hygroscopicus 042403。另外对活性菌株030603,以小麦纹枯为靶标菌,进行了发酵工艺的优化。采用单因子试验与正交设计相结合的方法,确定菌株030603液体发酵培养基组成及培养条件为:黄豆粉1.5%,蛋白胨3%,甘油1.5%,可溶性淀粉2%,盐度0%.,PH 5-7,种龄2d,接种量:6%,培养时间:5d,250mL三角瓶装液量75mL。菌株030603发酵优化后,次级代谢产物粗提物(1 mg/mL)对小麦纹枯病菌的抑菌活性达到98.78%,较基础发酵培养基抑菌活性(87.5%)有大幅度的提高。
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