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牛疱疹病毒Ⅰ型（Bovinehepersvirus Ⅰ,BoHV-1）,又称牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus,IBRV）,属于 α-疱疹病毒亚科,可引起急性、热性、接触性牛传染性鼻气管炎（Infectious bovine rhinotracheitis,IBR）,该病在世界多个国家和地区不同程度地发生与流行。养牛业发达国家以疫苗免疫预防为主并结合净化持续感染牛的策略防控IBR。尽管我国已经研制了 IBR灭活单苗,但尚未大范围应用推广;同时,疫苗免疫不能清除持续感染。因此,在注重疫苗免疫预防及新型疫苗研制的同时,需要深入研究病毒复制机制,特别是病毒装配和释放的分子机制,以期发现调控BoHV-1复制的关键基因,为抗病毒药物的研发提供靶标分子。Exo70蛋白是胞外分泌复合体（exocyst）8个亚基中的关键亚基,参与分泌囊泡胞内运输,介导分泌囊泡在细胞膜上的锚定,促进分泌囊泡内物质外排。尽管Exo70在维持细胞形态、构建细胞连接、促进细胞迁移等方面发挥重要作用,但与病毒复制关系的研究,鲜有报道。α-疱疹病毒粒子次级包膜及形成病毒分泌囊泡在反面高尔基体管网状结构（Trans Golgi network,TGN）上完成,但其从高尔基体运输到质膜及其释放的机制还知之甚少。本研究以分析检测Exo70与病毒粒子分泌囊泡向细胞膜运输及释放的关系为切入点,初步探讨了 Exo70促进BoHV-1复制的分子机制。主要实验结果如下:（1）Exo70 促进 BoHV-1 释放。通过qPCR和Western Blot实验对BoHV-1感染MDBK细胞不同时间点的Exo70的表达进行检测,发现Exo70mRNA的表达始终上调,Exo70蛋白表达在病毒感染12 h上调,但24 h表达下调。过表达Exo70基因后,与对照组相比,上清液中病毒的滴度由106.4 TCID50/mL上升至107.07 TCID50/mL,升高了 100.67倍,而总毒价不变;利用shRNA抑制Exo70的表达后,上清中病毒滴度由106.93TCID50/mL下降至105.8 TCID50/mL,下降了101.13倍,总毒价不变。上述结果表明,Exo70基因不影响病毒的增殖,但影响病毒的释放。（2）Exo70促进BoHV-1分泌囊泡向质膜的运输。利用透射电镜观察BoHV-1感染的MDBK细胞样本,发现BoHV-1的二次包膜出现在TGN上。通过BFA及Monensin阻断高尔基体-质膜转运途径后,免疫荧光技术检测BoHV-1感染的MDBK细胞,非药物处理的对照组BoHV-1 gB蛋白与高尔基体Marker的GM130共定位少,在胞质及质膜上都有分布,而经BFA处理的细胞GM130呈现弥散分布,GM130与gB蛋白共定位明显,细胞膜上的gB蛋白显著减少;经Monensin处理的细胞,GM130呈现聚集状态,与gB蛋白共定位显著增多,并且gB蛋白主要分布在高尔基体,在质膜上没有检测到。通过透射电镜观察,Monensin处理组高尔基体附近的病毒粒子数量较对照组多,而释放到胞外的病毒粒子数量明显比对照组少。上述结果表明,BoHV-1的胞内运输依赖于高尔基体-质膜转运途径。利用免疫荧光标记技术检测发现,在BoHV-1感染期间,Exo70与gB蛋白共定位于细胞膜;抑制Exo70表达后,BoHV-1 gB蛋白主要聚集分布于胞质中,与GM130共定位,很少分布在细胞膜上;通过透射电镜观察发现,抑制Exo70表达后胞内的病毒粒子较对照组多,而释放到胞外的病毒粒子数量明显比对照组少。上述结果表明,Exo70促进了 BoHV-1向质膜的运输。（3）Rab11a可能参与Exo70调控的BoHV-1的胞内运输。利用qPCR及Western Blot检测BoHV-1感染细胞样本发现,与对照细胞相比,Rab11a mRNA的表达始终上调,蛋白表达在病毒感染12 h上调,但在24 h下调。分别过表达以及抑制Rab11a后,检测病毒TCID50变化,发现Rab11a促进BoHV-1复制;利用shRNA抑制Rab11a的表达后,病毒滴度由107.42TCID50/mL 下降至106.76 TCID50/mL,下降了100.66倍。利用免疫荧光标记技术检测发现,病毒gB与Rab11a共定位,BoHV-1感染促进了 Rab11a与Exo70的胞质定位;通过免疫共沉淀技术检测发现,Rab11a分别与BoHV-1 gD和gE存在相互作用,Rab11a与exocyst复合体亚基Sec6、Sec10结合,且BoHV-1感染促进了 Rab11a与Sec10的结合;利用免疫荧光技术定位gB蛋白,发现抑制Rab11a后会抑制BoHV-1向质膜的运输。上述结果表明,Rab11a可能参与了 Exo70调控的BoHV-1的胞内运输。（4）BoHV-1感染后期,E3泛素连接酶STUB1促进了 Exo70的泛素化降解。病毒感染后期,蛋白表达下调,MG132处理后Exo70蛋白表达回调,表明Exo70蛋白发生了泛素化降解。通过亲和纯化并结合质谱分析方法高通量筛选与Exo70结合的蛋白,发现STUB1为候选的E3泛素连接酶;利用免疫荧光标记技术检测发现,BoHV-1感染细胞中STUB1与Exo70共定位;利用免疫共沉淀技术,验证STUB1与Exo70结合;共转染STUB1及Exo70重组表达质粒,发现STUB1促进了 Exo70的泛素化修饰,抑制Exo70蛋白表达,过表达STUB1缩短了 Exo70的半衰期;对STUB 1的酶活性位点进行突变后,发现STUB 1对Exo70的泛素化依赖于其酶活性。上述结果表明,在病毒感染24 h时,宿主细胞通过E3泛素连接酶STUB1促进Exo70的泛素化降解。综上所述,本研究率先发现Exo70基因促进BoHV-1复制过程中的胞内运输和释放及其作用机制,为深入探讨BoHV-1的复制机制提供了新的视角和平台,为了解Exo70在病毒粒子生命周期中的作用及其机制提供直接证据,为抗BoHV-1药物研发提供了新的思路和靶标分子。