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1,3-丁二醇(13BDO)是一种重要的有机和精细化工原料,应用广泛。目前,工业上生产1,3-丁二醇主要采用乙醛缩合加氢工艺,原料来源于石油化工。随着全球化石能源的消耗,寻找可再生替代资源成为当务之急,研究生物法生产1,3-丁二醇的工作有重要的理论意义和应用价值。本论文以酿酒酵母为研究对象,首次对酿酒酵母细胞内的1,3-丁二醇非天然合成路线进行了构建研究。在酿酒酵母细胞内原有代谢途径基础上,设计了以乙酰辅酶A为出发化合物,经双乙酰辅酶A还原成3-羟基丁酰辅酶A,再脱乙酰辅酶A形成3-羟基丁醛,最后由乙醇脱氢酶还原成1,3-丁二醇的非天然代谢途径。以安全可靠的食用菌株安琪酵母为出发菌株,利用CRISPR/cpf1基因编辑技术,破坏掉酵母URA3基因,造成目标基因功能缺失,成功得到URA3功能缺失的营养缺陷型宿主菌Saq。针对合成路线中所需要的催化3-羟基丁酰辅酶A转变成3-羟基丁醛的酶,选择了两种具有较宽的乙酰类底物催化范围的外源基因Aldh和BphJ,利用CRISPR/Cas9技术,把外源基因Aldh、BphJ和EGFP表达框整合进酿酒酵母δ位点,得到带有1,3-丁二醇途径的工程菌株Saq-Fab。工程菌株的表现型和分子实验均验证基因Aldh和BphJ已经插入酵母基因组且稳定遗传表达,理论上完成了酿酒酵母细胞内1,3-丁二醇非天然途径的构建。但代谢产物中未检测到目标产品1,3-丁二醇。为促进1,3-丁二醇的产出,从调控酿酒酵母的代谢流、阻断乙醇的代谢途径方面进行了进一步的研究。利用CRISPR/Cas9技术定点突变ADH1基因使其丧失所属功能,成功降低了乙醇产量,使乙醇途径上游中间代谢产物积累,且导入了合成双乙酰辅酶A的外源基因thlA,提高了双乙酰辅酶A的合成量,理论上已经有足够的前体供给1,3-丁二醇下游途径合成目标产品1,3-丁二醇。然而,仍未检测到目标产品1,3-丁二醇的产出,推测其原因很可能是酶Aldh和BphJ不能有效催化3-羟基丁酰辅酶A转化成3-羟基丁醛,无法使代谢流拉向1,3-丁二醇途径。